血凝(HA)试验的改进

莫静华，黎剑威，徐 勒，黄玉淑，韦建华

(广西壮族自治区河池市动物疫病预防控制中心，广西 河池 547000)

0 引言

一些病毒具有凝集红细胞的特性，根据这个特性再结合抗原与抗体的特异性结合的原理，设计出针对该种病毒的血凝(HA)试验与血凝(HI)抑制试验，通过该试验可以检测出血清中该病毒的抗体效价情况，从而评价该病毒的疫苗效果情况或是推测感染史。血凝与血凝抑制试验因简单、快速等特点，是试验室中一种很常用的检测血清抗体效价的方法。血凝(HA)试验中，血凝价的测定与判定很关键，个人判定常常带有主观因素，判定不正确，将影响到血凝(HI)抑制试验4单位抗原的配置，最终影响后续血清抗体的结果判定。血凝(HA)试验中，一般为了准确，需要做3个平行的试验，之后判定血凝价是落在哪一个孔上，这样做只能得到一个比较宽范围的数值，比如血凝价判为512或是1 024，不能准确的得出具体数值。本文对血凝(HA)试验进行改进，使用“素数”浓度倍比稀释，错开重叠浓度比，力求在同等条件下更为准确地测定血凝价，其过程如下。

1 材料

1.1 仪器

研究需要1.2～20 μL移液器、20～200 μL移液器、8道5～50 μL移液器、微型振荡器。

1.2 试剂和耗材

试验所需要的试剂和耗材有移液器头(若干)、一次性90° 96孔“V”型微量反应板(1块)、1%鸡红细胞、PBS、待测抗原。

2 方法

2.1 加稀释液

取一次性96孔反应板，竖着摆放并按表1抽取稀释液分别加入反应板第一列的各个孔中，其余空白孔全部加入25 μL PBS。第一列加入不同的稀释液，为下一步倍比稀释出不同浓度做准备工作。

表1 第一列稀释液体积 单位：μL

2.2 稀释需要的浓度比

使用移液器取80 μL待检抗原，混于第一孔中，然后分别按照如下体积取液。

在第一孔混匀后取出110 μL的体积混到第三孔(跨过第二孔，竖下来按列加样)，第一孔剩下体积为50 μL，其浓度为1:2，如此计算。

在第三孔混匀后取出115 μL的体积混到第四孔，该孔剩下体积为50 μL，其浓度为1:3。

在第四孔混匀后取出142 μL的体积混到第五孔，该孔剩下体积为50 μL，其浓度为1:5。

在第五孔混匀后取出149 μL的体积混到第六孔，该孔剩下体积为50 μL，其浓度为1:7。

在第六孔混匀后取出184 μL的体积混到第七孔，该孔剩下体积为50 μL，其浓度为1:11。

在第七孔混匀后取出167 μL的体积混到第八孔，该孔剩下体积为50 μL，其浓度为1:13。

在第八孔混匀后取出168 μL的体积混到第九孔，该孔剩下体积为50 μL，其浓度为1:17。

在第九孔混匀后取出138 μL的体积混到第十孔，该孔剩下体积为50 μL，其浓度为1:19。

在第十孔混匀后取出117 μL的体积混到第十一孔，该孔剩下体积为50 μL，其浓度为1:23。

在第十一孔混匀取出98 μL的体积混到第十二孔，该孔剩下体积为50 μL，其浓度为1:29。

在第十二孔混匀后取出55 μL的体积弃掉，该孔剩下体积为50 μL，其浓度为1:31。

本步骤的目的在于稀释后浓度比为素数比，使用素数比浓度在下一步倍比稀释放大后，将会稀释出不重复的稀释浓度比。

2.3 倍比稀释

对第一行第一孔取25 μL进行倍比稀释，直到稀释到反应板的最后一个孔(第八孔)，之后取出25 μL后滴加到第二行的第一孔，然后再进行该行的倍比稀释到第四孔即可。第三行，则取出25 μL以行进行倍比稀释至第八孔，之后弃掉25 μL；其他行均如此进行倍比稀释。

当进行完毕以上操作之后，反应板所有的孔的体积均为25 μL。

最终一次性反应板中各个孔的浓度比如表2所示。

表2 最终一次性反应板中各个孔的浓度比

3 结果

3.1 血凝试验结果

对整块反应板，每个孔分别加入25 μL，1%鸡红细胞之后，在加入一次25 μL的稀释液，震荡25 s后等待30 min看结果[1]。假设使用某种方法精确的测出某抗原的真实血凝价为970，那么利用文中的方法重新测定血凝价，以比较其误差情况。正确操作后，结果如表3所示。

表3 改进的血凝试验检测结果

3.2 结果的显示方式

建议打印一张上图的浓度表，根据一次性反应板上的结果，在浓度表中使用“+”“-”符号标出反应板的血凝价的结果，之后绘制一条直线，把每一行的血凝价的临界范围的数值统一标注在这条直线上，缩小范围，从直线上分别寻找出最小滴度的血凝价和最大滴度血凝价，得到血凝价的临界范围，取临界范围两端血凝价数值进行平均，得到一个平均值，这个数值即为测定的血凝价的最佳数值，如图1所示。

图1 血凝试验结果绘制直线图

从图1中取到临界范围(928、992)，两数值平均值为:(928+992)/2=960。960即为本方法测定下的最终血凝价。与常规血凝试验比较可知，如果血凝价定为512，显然与960相距甚远，如果血凝价定为1 024，显然又不足，一般有经验的试验员就会取中间值:(512+1 024)/2=768，768与970相差202个单位，960与970相差10个单位，经比较之后，使用文章中的方法比较接近真实数值。

4 讨论

1)血凝和血凝抑制试验是实验室常用的免疫抗体检测技术之一，主要用于鸡新城疫和禽流感病毒病的检测诊断以及监测鸡的免疫状态[2]。在进行本试验时，需要注意试验条件的标准化，这样保证结果更具准确性和可靠性。在进行试验前，需要将可能会影响到本试验是一些影响因素进行分析，并且采取措施尽量避免这些因素造成对结果的影响。

首先，红细胞的来源和浓度，红细胞最好是采集3～4只健康且没有免疫的禽，这样可以避免出现红细胞自凝的情况[3]，减少这种情况对结果造成干扰。而且选取红细胞的禽需要每半年进行更换；红细胞要经过充分的清洗，将其血清彻底洗去；红细胞的浓度通常为0.5%～1%，通常应用的浓度为1%。在制作红细胞时，一般应用3.8%的柠檬酸钠作为抗凝剂，抗凝剂的配制是在三角瓶中加入100 mL的纯水和3.8 g的柠檬酸钠，将其混合均匀后置于15磅的压力下经过15 min灭菌后，分装冻存。在采集鸡血时，按照1/10的量在注射器中加入柠檬酸钠，而后与采集到的血液混合后应用PBS进行清洗，PBS的用量最少为所采集血量的10倍。在清洗红细胞时，次数不能过多，否则容易引起红细胞的破裂，通常是在清洗后发现上清液清亮为宜，如果清洗次数过多，会表现出清洗液的上清液呈现出淡红色甚至是红色，出现红细胞的破裂。制备好的红细胞，需要通过对其血沉进行观察，将血沉不合格的红细胞弃去。这样制作好的红细胞悬液需要在4℃进行保存，保存时间不能够超过2 d。当其保存时间过长或者在保存的过程中受到病原菌的污染，会使得红细胞出现自凝的情况，从而对血凝试验的结果产生影响。如果对所用的红细胞进行醛化，可使红细胞的性质变稳定，从而更容易保存，即使在蒸馏水中也不会出现溶血情况。这种红细胞可以在4℃的条件下保存，最长可以保存1年。而且应用这种醛化的红细胞使用方便、稳定、结果均一，且容易判定结果，但反应结果会比用新鲜的红细胞效价低1～2个。

其次，缓冲液的配制，在新城疫和禽流感的检测中，国家标准所应用的缓冲体系是0.01 M pH 7.2PBS。这种缓冲液最好在应用前进行配制，经过高压灭菌后就可以使用，不用时可以放入冰箱中冷藏保存，但保存时间不能超过30 d。当取出PBS时，如发现其中有大量的絮状沉淀物，就需要将其弃去，不能继续使用。通常，PBS在配制好后不需要调节pH值，直接经过灭菌后冷藏保存即可。如果确实需要调节，可以应用NaOH溶液。由于病毒的最适宜pH值6～7.2，因此，需要用酸碱度的缓冲液，当缓冲液的pH值低于5.8时，就容易引起红细胞的溶血，当pH值高于7.8时，则在红细胞上吸附的病毒会出现脱落情况，因此，缓冲液配制尤其重要，其对结果的影响也相当大。在调节pH值时，要注意应用酸度计更为准确，如果仅仅是用pH试纸，则结果不准确。也可以应用直接做好的PBS粉进行配制，方便，可靠。如果确实没有PBS，可以应用林格氏液进行配制，也具有相似的应用效果。

还要注意血凝板和微量振荡器的应用。在进行试验时，通常是应用一次性的血凝板，这样可以确保结果的相对可靠和有效，这种血凝板通常是塑料的，应用时也方便，也可以选用可重复使用的血凝板，通常为聚苯乙烯制成，但在购买时需要注意购买90度角，且底面光滑的板。在应用前要检查孔内是否清洁，如果不清洁，需要应用蘸有酒精的棉签对孔内进行擦拭，待擦干净后才可以应用。这种板的好处是可以上下进行叠放，这样在进行大量试验时，可以有效节省空间。在应用完成后，也要应用加压后的高压水将每个孔都进行冲洗，而后将其中的水分甩干后置于恒温培养箱中进行烘干，备用。在应用微量振荡器时，需要注意震动的幅度，幅度不能太大，时间也不能过长，通常10 s左右即可。当应用多块血凝板进行叠加后震荡时，要将最上边的板子下压，这样可以避免其中的液体外溅，从而对结果造成影响。

最后还要关注器材的使用，通常应用单道或者是多道的微量移液器，这种移液器需要在使用前进行校正。在使用时要注意将每个吸头都固定好，避免出现漏气的情况，并要防止加样时出现气泡，而且用力要均匀，这样可以防止量取不准的情况。在应用时，要注意移液器与血凝板保持垂直，可以使得结果更准确。

2)该方法优点是在对血凝(HA)试验改进之后，利用不同浓度比来对抗原效价进行测定，相对于原先血凝价的测定，更为精确，4单位抗原配置也更为可靠。经过上述方法测定之后的4单位抗原配置，可以不需要再做回滴试验。在用量方面，使用抗原80 μL，传统血凝(HA)试验，一般做3个平行试验，每个试验用抗原量为25 μL，总计需要75 μL 的抗原用量，用量方面差不多。试验虽然是对血凝(HA)试验改进，但也可以拓展于其他溶液原浓度的测定。上述方法的特点是使用素数浓度比进行倍比稀释，错开各个可能会重复的稀释度，最终将血凝价锁定到2个较窄的范围内，最后取两浓度的“平均”值，通过如此改进能更快逼近真实的血凝价浓度。另外，该方法还可以避免主观错误，某一行判定不确定时，对结果并不会有很大影响，因为其他行的血凝价也会矫正这一行的结果。应用该方法的缺点是稀释液体积难以控制，试验中使用的是20～200 μL的移液器，精度上得不到保证，经过该方法测定的抗原效价仍然没有算出抗原的真正效价水平。试验只是缩小了效价范围，所以最后取两端平均数较为合理。另一个缺点是，在操作过程中，一次性反应板的孔不能容纳200 μL的溶液，所以在某些孔的稀释过程中，就不能将吸头中的液体全部吹打出去，但是可以进行多次缓慢的吹打以达到使液体混合均匀的目的，这也增加了试验的操作难度。

3)血凝试验的结果通常仅对当次试验有效，当过段时间再进行试验时，就要对血凝价进行重新测定，尤其是在天气炎热的夏季。而且血凝价和所用的红细胞悬液是进行配套使用的，当所用的红细胞不是同一批时，必须重新测定血凝价，这样才能确保实验的准确。但血凝试验完成后，应用的四单位抗原保存也要立即进行冷冻后才能够减少效价的损失。在进行血凝试验时，加入红细胞后，对结果的观察需要经过30 min，在气温较低的季节，可以适当延长至40 min。直到空白孔中的液体变清亮时再进行读数，这样的结果才更准确可靠。

4)该研究通过对血凝试验的传统方法进行改良，可以在临床应用中更准确地检测出抗原的效价，这样在进行抗原配制时，就可以更准确。只有4单位抗原的准确配制，才能够在血凝抑制试验中对抗体效价检测时，获得准确的效价，该试验的结果也更具有参考价值。