同时测定维生素预混合饲料中VA、VD3、VE含量的方法研究

杨海涵，胥世洪，李 军，房春林

(1.成都乾坤动物药业股份有限公司，四川 成都 610000；2.四川省兽药监察所，四川 成都 610000；3.成都农业科技职业学院，四川 成都 610000)

0 引言

VA、VD3、VE常作为添加剂用于畜禽饲料中，特别是预混合维生素饲料中，三者同时添加的概率比较大[1-3]。在现行的预混合维生素饲料检测方法中，3种维生素分别进行直接提取后检测，三者流动相均为甲醇:水(98:2)，检测波长分别为326 nm、264 nm、285 nm，流速等其他条件差异不大[4-6]。在检测时发现，VA、VD3、VE均能出现分离度合格的色谱峰，因此，试验对VA、VD3、VE同时测定展开研究[7]。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

Agilent-1260高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司；岛津SPD-M20A、LC-15C、LC-20A高效液相色谱仪，岛津(中国)有限公司；BP211D型分析天平，中国(北京)赛多利斯有限公司；UV-1800PC紫外-可见光分光光度计，上海美诺达仪器有限公司。

VA醋酸酯对照品，中国药品食品检定研究院，含量98%，批号100368-201502；VD3对照品，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，含量98%，批号F1813051；D-α-生育酚对照品，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，含量97%，批号H1815030。

维生素预混合饲料“多维营养素”，VA、VD3、VE均为水溶性包合物，成都欣牧生物科技有限公司，批号为20200408。

1.2 方法

1.2.1 波长选择

分别精密称取VA、VD3、VE对照品适量，置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，使分别含VA、VD3、VE约1 mg/mL，于200～400 nm扫描，确定3种维生素均有吸收的波长范围。根据紫外扫描结果，分别对VA、VD3、VE混合液进行检测，流动相为甲醇:水(98:2)，柱温30℃，流速1 mL/min。记录色谱图，分析主峰的峰面积大小、分离度、理论板塔数及对称性，从而选择最优的检测波长。

1.2.2 绘制标准曲线

精密配置含VA 0.173 0 mg/mL、VD30.161 7 mg/mL、VE 2.111 6 mg/mL的混合溶液，倍比稀释6次。将以上7种溶液分别注入液相色谱仪检测，记录峰面积，并以峰面积对浓度作图，分别得到3个维生素的线型回归方程，r2应不小于0.999 9。

1.2.3 条件稳定性评估

按照兽药典的规定，对建立方法的精密度、重复性、回收率进行检测，应符合规定。

1.2.4 样品检测及实用性试验

取预混合维生素添加剂样品，分别用Agilent-1260高效液相色谱仪(紫外检测器，SB-C18色谱柱)、岛津SPD-M20A高效液相色谱仪(光电二极管阵列紫外检测器，岛津OSD-2色谱柱)、岛津LC-15C高效液相色谱仪(紫外检测器，依利特OSD-2色谱柱)、岛津LC-2010-AHT高效液相色谱仪(紫外检测器，岛津OSD-2色谱柱)进行检测，计算样品含量并进行分析，各种设备检测结果差异应不显著。

1.2.5 与原方法比较

取预混合维生素添加剂样品，分别用VA、VD3、VE单独检测方法进行检测，检测结果与该次实验结果进行比较，差异应不显著。

2 结果

2.1 色谱条件选择

将VA、VD3、VE的混合溶液置于紫外-可见风光光度计扫描，发现279～290 nm VA、VD3、VE的吸收值相对平衡。通过高效液相色谱间隔3 nm波长进行检测发现，当波长为288 nm时，VA、VD3、VE 3个主峰的峰面积、分离度、理论板塔数及峰的对称性等均优于其他波长。调整流动相中甲醇浓度，并检测3种维生素在30 min内的图谱，当甲醇浓度为98%、100%时，3种维生素均在30 min内出峰，但峰的分离度98%优于100%，因此，以甲醇:水(98:2)作为流动相。

2.2 绘制标准曲线

将含有VA、VD3、VE的混合标准品溶液，倍比稀释后。分别注入液相色谱仪测定峰面积并记录，并用测得峰面积对浓度作图得标准曲线方程。

VA:y=14 113x+22.271，R2=0.999 9，线性范围:0.002 7～0.173 0 mg/mL。

VD3:y=0 056x+7.535 6，R2=0.999 9，线性范围:0.002 5～0.161 7 mg/mL。

VE:y=10 217x+132.78，R2=0.999 9，线性范围:0.033 0～2.111 6 mg/mL。

2.3 精密试验

取标准品混合液，重复进样6次，记录峰面积并分析，得出3种维生素的变异系数均(R)小于2.0%，分别为1.30%、0.52%、0.47%，说明本系统精密度良好，具体如表1所示。

表1 精密度试验

2.4 重复性试验

精密称取预混合维生素饲料样品6份，加甲醇稀释后，将6种溶液分别精密量取10 μL滤过后注入液相色谱仪检测，记录峰面积并分析，发现变异系数(R)均<2.0%，分别为0.46%、1.30%、0.28%(见表2)。

表2 重复性试验

2.5 回收率试验

按照重复性试验项下处理样品溶液，分别加入对照品使溶解。摇匀后稀释至刻度，滤过后注入液相色谱仪检测，记录峰面积计算溶液浓度，并计算对照品的平均回收率分别为100.10%、99.20%、97.92%(均>95%)[7]，变异系数(R)均<2.0%，分别为0.96%、0.86%、1.23%，说明该方法回收率良好，重复性高，如表3所示。

表3 3种维生素回收率试验

2.6 适用性试验

取重复性试验项下稀释样品(5 g→100 mL)，分别用4种不同液相色谱仪进行检测，外标法计算含量并进行分析，结果得出各组数据差异不显著(p<0.05)，说明该方法可以同时测定预混合饲料添加中VA、VD3、VE的含量，且适用性较好，如表4所示。

表4 适用性试验 单位：mg/mL

2.7 与原方法比较

取重复性试验项下稀释样品(5 g→100 mL)，分别用VA、VD3、VE单独检测方法进行检测，与该实验方法及实验结果进行比较，差异不显著(t<0.05)，具体如表5所示。

表5 与原方法比较 单位：mg/mL

3 结论

综上所述，该方法可用于预混合维生素饲料中VA、VD3、VE的含量测定。线性关系、精密度、重复性及回收率均比较良好，因此，此法可以用于实际生产中，其具体参数为流动相甲醇:水(98:2)，波长288 nm、柱温30℃，流速1.0 mL/min。另外，该次试验用甲醇:水(98:2)为流动相，检测范围分别为2.7～173.0 μg/mL，2.5～161.7 μg/mL，33.0～2 111.6 μg/mL，与文献比较，VA和VE的检测限度较低，流动相相对简单[8-9]。

该次试验中，对样品的处理仍然采用原标准中的处理方法，即精密称定样品，加入适量甲醇，60℃超声处理1 h，冷却后加甲醇至刻度。原标准中需要调整3次波长，按标准进样方法需要进样9次，甲醇的消耗量比较大，且所需时间较长，该次试验将甲醇的消耗和所需时间均降低至原来的1/3，因此，优于3种维生素的单独测定。但是，该次试验只针对能直接提取VA、VD3、VE的预混合维生素饲料样品检测，对于动物或植物体内需要进行转化后或者成分复杂样本的VA、VD3、VE的检测，需要进一步研究。