基于聚类分析和主成分分析的乌鸡白凤丸RRLC指纹图谱研究

庞 威，樊 杰，纪天一,鲁玉娇，闫胜楠，郭英侠

（吉林紫鑫药业股份有限公司·吉林 通化·134000）

乌鸡白凤丸又称“白凤丸”俗称“乌鸡调经丸”，由明·龚廷贤《寿世保元》卷七的乌鸡丸加减而成,原方出自唐朝,经宋、元、明数代沿用和多次修订,现已收载于《中国药典》2020版一部中,处方中包括乌鸡(去毛爪脏)、鹿角胶、醋鳖甲、煅牡蛎、桑螵蛸、人参、黄芪、当归、白芍、醋香附、天冬、甘草、地黄、熟地黄、川芎、银柴胡、丹参、山药、芡实（炒）、鹿角霜二十味药材。有补气养血、调经止带的功效。临床上常用于治疗气血两虚、身体瘦弱，腰膝酸软，月经不调，崩漏带下[1]。

本实验采用高分辨快速分离液相法（RRLC）对不同厂家、批次、剂型的乌鸡白凤丸进行测定，建立了乌鸡白凤丸RRLC特征图谱，同时对数据结果进行系统聚类分析和主成分分析，取得了比较理想的分析结果，实验结果可以用来评价乌鸡白凤丸的真实性，优良性和稳定性，能够较为全面的反应其所含化学成分的种类，能够对乌鸡白凤丸质量进行整体描述和评价。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

Agilent1200高效液相色谱仪，美国Agilent公司；FA2004A电子天平，上海精天电子仪器厂；精宏DMG-9123烘箱，上海精宏实验设备有限公司；KQ-500DA数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

1.2 试剂

甲醇（分析纯），北京化工厂；甲醇、乙腈（色谱纯），Amethyst Chemicals。

1.3 试验药品

不同厂家、剂型乌鸡白凤丸产品。详见表1。

表1 乌鸡白凤丸样品

2 实验方法

2.1 供试品溶液制备

取乌鸡白凤丸，剪碎，精密称取5g，置于50mL具塞锥形瓶，加甲醇25mL，称重，记录，浸泡过夜。超声处理50min(100HZ)，补足减失液，过滤，取滤液通过0.45μm滤膜，作为供试品。

2.2 色谱条件

色谱柱：Elipse C18(1.8μm,3.0×100mm Agilent)；柱温35℃；检测器：DAD；检测波长203nm；流动相A为超纯水,B为乙腈；洗脱梯度：0-5min,40%B;5-15min,40-65%B;15-17min,65%B;17-20min,65-70%B;20-25min,70-75%B;25-30min,75-85%;35-40min,85-95%B;40-45min,95-100%;45-50min,100%B;流速：0.6ml/min；进样量：5μL。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验取

取同一批乌鸡白凤丸供试品溶液，连续进样6次，测定并记录色谱图。结果表明,各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别在0.005%～0.1%和0.02%～1.5%,均小于3.0%,表明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验

取同一批乌鸡白凤丸样品,分别制备6份供试品溶液,进行测定。结果表明,各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别在0.008%～0.4%和0.3%～3.2%,均小于5.0%,表明该方法重复性良好

2.3.3 稳定性试验

取同一批乌鸡白凤丸供试品溶液,分别于0、3、6、12、24h进样测定,考察其稳定性。结果表明，各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别在0.07%～0.6%和0.5%～2.7%,均小于5.0%,表明供试品溶液在24h内稳定。

3 结果与分析

3.1 乌鸡白凤丸RRLC特征图谱的建立

按照“2.1”项下方法制备供试品溶液，按照“2.2”项下色谱条件测定，对25批乌鸡白凤丸样品进行测定，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2004年版)进行分析，得到了25批乌鸡白凤丸的RRLC指纹图谱叠加图。通过对样品的测定，确定25批乌鸡白凤丸特征图谱中出峰时间基本一致，峰面积较大13个峰为共有特征色谱峰，可以较为全面地反映乌鸡白凤丸的内在质量，样品特征色谱图的色谱峰情况见图1。

图1 乌鸡白凤丸RRLC指纹图谱叠加图

3.2 聚类分析

以各乌鸡白凤丸样品色谱图的13个共有峰作为评价指标，以欧式距离作为衡量各剂型差别大小，采用最短距离法对各个乌鸡白凤丸进行聚类分析。25批乌鸡白凤丸样品，聚类谱系图见图2。

从图2可以看出，样品的聚类结果理想，这25个样品可聚为9类，即10-12(世一堂大蜜丸)处于一类，样品19-21（天福康水蜜丸）处于一类，5、6（药都大蜜丸）处于一类，1-3（老君炉大蜜丸）处于一类，13-15（刻康水蜜丸）处于一类，16、17（老君炉水蜜丸）处于一类，22-24（修正水蜜丸）处于一类，7-9（同仁堂大蜜丸）处于一类，25（同仁堂水蜜丸）单独处于一类，可明显地将样品按照厂家进行区分。

图2 乌鸡白凤丸聚类分析图

当距离约为15时，大体上可根据剂型将大蜜丸和水蜜丸分开，即如图11、12（世一堂大蜜丸），5、6（药都大蜜丸），1-3（老君炉大蜜丸）处于一类；16、17（老君炉水蜜丸），25（同仁堂水蜜丸），13-15（刻康水蜜丸），22-24（修正水蜜丸）处于一类；19-21（天福康水蜜丸）和7-9（同仁堂大蜜丸）例外，总体上来说实现了剂型的区分。

3.3 主成分分析

为了更仔细地观察各样品的差异，分别采集了各样品的RRLC图谱中主要吸收峰，即共有峰峰面积值为指标，采用SPSS13.0软件对其样品进行了主成份分析，将它们投影至低维空间来看它们之间的细微差别详见图3。

由图3可见，以特征值大于1为提取标准，得到2个主成份，累计贡献率为60.8%，得到基于前2个主成份得分图（图3）。主成份分析的贡献，PC1为43.3%，PC2为17.5%，其他的贡献率较小，累计贡献率为60.8%。其分析结果与聚类分析结果相一致，结果显示，根据剂型的不同，可将大蜜丸和水蜜丸分成两大组，即把大蜜丸和水蜜丸两类剂型分开，可以表达乌鸡白凤丸的剂型信息。同时不同厂家同样剂型的乌鸡白凤丸之间也能够分开。

图3 乌鸡白凤丸主成份分析得分图1

由图4可以看出，累计贡献率为62.4%，这25个样品可分为5类，即天福康水蜜丸、同仁堂水蜜丸、修正水蜜丸、刻康水蜜丸、同仁堂水蜜丸分别处于一类。可以表达同样是水蜜丸剂型的乌鸡白凤丸不同厂家的信息。

图4 乌鸡白凤丸水蜜丸主成分分析得分图2

由图5可以看出，累计贡献量为79.3%，这12个样品可分为4类，即世一堂大蜜丸、同仁堂大蜜丸、老君炉大蜜丸、药都大蜜丸各自的三个样品单独处于一类。可以表达同样是大蜜丸剂型乌鸡白凤丸不同厂家的信息。

图5 乌鸡白凤丸大蜜丸主成分分析得分图3

4 讨论

RRLC技术应用于乌鸡白凤丸的特征图谱研究，检测时间较快，比HPLC方法缩短了分析时间，同时也提高了分离度和灵敏度，减少了流动相的消耗。文中应用的方法所做的聚类分析结果与实际相符，说明聚类分析不但适合样品不同等级、规格的鉴定，也适合样品不同厂家及剂型的判别。

文中将25批不同的乌鸡白凤丸13个共有峰的单位质量峰面积作为变量，进行主成分分析结果与聚类分析结果基本一致。由此可见，在乌鸡白凤丸特征图谱的研究中，聚类分析可以对不同厂家、剂型的样品做初步分组，而主成分分析又能进一步验证聚类分析结果的准确性，为乌鸡白凤丸的鉴别与质量控制提供依据和参考。