植物乳杆菌防治鸡白痢沙门菌感染的效果评价

吕文亮， 张甜甜， 林显华， 鹿 瑶， 徐海燕， 谷 巍

（山东宝来利来生物工程股份有限公司/山东省动物微生态制剂重点实验室，山东泰安271000）

鸡白痢是一种常见的禽类疾病，不同品种鸡都易感，2 ~ 3 周龄发病率和死亡率最高，严重时病死率可达100%（孟繁新，2020），给养鸡业带来严重的损失。以前使用抗生素是临床常见的预防和治疗白痢沙门菌感染的方法，然而，这也同时造成了越来越严重的沙门菌耐药性。 自从2020年7 月1 日我国饲料施行全面禁抗以来，畜禽养殖面临着巨大地挑战，人们迫切需要安全、绿色、有效的产品替代抗生素。 研究证实，益生菌是对宿主健康发挥有益作用的微生物，可有效抑制家禽肠道病原菌，提高生长性能，调节肠道菌群，刺激机体免疫功能（闫一博等，2021；于明等，2021；蒋磊等，2019；Jae 等，2013；Akira 等，1990）。许多报道证实乳杆菌对鸡白痢沙门菌具有很好的作用。 罗伊氏乳杆菌ATCC 55730 可显著提高沙门菌诱导的雏鸡鸡白痢疾病模型的存活率（Zhang等，2012）；干酪乳杆菌DBN023 可减少鸡白痢沙门菌CMCC-533 对肠道的损伤， 保护肠道组织（Wang 等，2019）。 已有研究表明， 乳杆菌LB-9703 制剂治疗鸡白痢沙门菌的效果与抗生素功效相同， 可用于替代抗生素治疗鸡白痢沙门菌（ 郭 延 军，2001）。 植 物 乳 杆 菌（Lactobacillus plantarum） 是目前报道较多的对沙门菌属（Salmonella spp.）有拮抗作用的益生菌物种之一（Sofyan 等，2019；Varmuzova 等，2016；Yin 等，2015）。 本研究选用植物乳杆菌BLCC2-0410（以下称植物乳杆菌0410），应用人工感染鸡白痢沙门菌的雏鸡，研究其对雏鸡死亡率、脏器沙门菌载菌量、肠道乳酸菌数量、血液生化指标、免疫球蛋白和炎症因子的影响， 来评估该植物乳杆菌BLCC2-0410 对雏鸡沙门菌感染的防治效果。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 益生菌株 植物乳杆菌0410 （BLCC2-0410）， 由山东宝来利来生物工程股份有限公司，生物工程研究院菌种资源保藏中心提供。

1.1.2 攻毒菌株 鸡白痢沙门菌CVCC533，购买自中国兽医药品监察所。

1.1.3 主要试剂与仪器 MRS 培养基，按质量百分数计， 葡萄糖2.0%、 柠檬酸铵0.2%、 乙酸钠0.5%、磷酸氢二钾0.5%、硫酸锰0.02%、硫酸镁0.05%、蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母膏0.5%、吐温－80 0.1%，pH 6.0， 固体培养基需要加1.5%琼脂粉。 LBS 琼脂培养基、SS 琼脂培养基，购自青岛海博生物技术有限公司。 免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白IgM、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、干扰素-γ（IFN-γ）、白介素-1β（IL-1β）测试盒，均购自南京建成生物工程研究所。 Thermo 酶标仪，购自赛默飞世尔上海仪器有限公司。DHP－9082 电热恒温培养箱，购自上海一恒科学仪器有限公司。 全自动生化分析仪（KHB卓越330），购自科华生物。

1.2 试验设计 1 日龄健康海兰褐雏鸡120 只，购自泰安东岳种禽有限公司。 经肠道菌群和平板凝集试验检测，雏鸡未携带鸡白痢沙门菌。逐只称重，按体重平均分配到12 组中，10 只/组，每组雏鸡的平均体重基本一致， 设置空白对照组（CK组）、感染组（S 组）、益生菌组（R 组）3 个处理组，每个处理组4 个重复。

1.2.1 益生菌制剂的饲喂 自1 日龄开始饲喂雏鸡益生菌制剂，采用自由饮用的方式，每只鸡平均饮用2 mL/d，0 ~ 3 日龄雏鸡饮水中活菌浓度为1.0×1010cfu/mL，4 ~ 7 日龄雏鸡饮水中活菌浓度为1.0×109cfu/mL，8 ~ 10 日龄雏鸡饮水中活菌浓度为1.0×108cfu/mL。

1.2.2 攻菌菌液制备 将鸡白痢沙门菌CVCC533 接种到TSB 培养基中，37 ℃，180 r/min，培养24 h， 将菌液转至无菌离心管中，5000 r/min离心10 min，弃上清，收集菌泥，用无菌生理盐水重悬，制成4.0×109cfu/mL 浓度的攻毒菌液。

1.2.3 人工感染试验 3 日龄开始进行鸡白痢沙门菌感染， 经口灌喂上述鸡白痢沙门菌菌液，0.5 mL/只，共进行两次。 第1 次攻菌前停饲16 h，断水0.5 h，攻菌后0.5 h 恢复饮食饮水；第2 次攻菌前0.5 h 停饲停水，攻菌后0.5 h 恢复饮食饮水。 2 次攻菌在24 h 内完成。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 死亡率 从试验开始到试验结束， 每天统计雏鸡死亡只数，最后计算雏鸡死亡率。

1.3.2 脏器沙门菌载菌量 试验结束后， 每处理组取3 只未死亡雏鸡，心脏采血后处死，无菌取肝脏、脾脏和肾脏，分别制备成10%（m/m）的组织匀浆液，经10 倍倍比稀释，通过平板计数法测定脏器沙门菌载菌量。

1.3.3 肠道乳酸菌数量 取0.5 g 肠道内容物溶于4.5 mL 生理盐水中进行10 倍倍比稀释， 选择合适的稀释梯度进行菌群数量测定。 使用平板计数法测定肠道内容物中乳酸菌数量。

1.3.4 血清免疫指标 试验结束后， 每处理组取3 只未死亡雏鸡，心脏采血，分离血清。 按试剂盒说明书进行IgA、IgM、IgG 的测定。

1.3.5 血清炎症因子检测 按试剂盒说明书进行IL-1β、IFN-γ 及TNF-α 的测定

1.3.6 血液生化指标 用全自动生化分析仪 （卓越330）检测血清球蛋白、白蛋白、总蛋白及谷草转氨酶含量。

1.4 数据统计与分析 数据用Excel 2010 初步整理， 使用SPSS 13.0 进行单因素方差（ANOVA）分析，组间数据用Duncan's 法进行多重比较，结果用“平均值±标准差”表示，P<0.05 表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 益生菌制剂对雏鸡死亡率的影响 由表1可知， 感染组和益生菌组雏鸡发病死亡率分别为82.5%、32.5%， 植物乳杆菌可降低雏鸡相对死亡率，较感染组降低60.6%，饲喂植物乳杆菌0410可有效的降低鸡白痢沙门菌感染雏鸡死亡率。

表1 各组雏鸡死亡率

2.2 脏器沙门菌载菌量 由表2 可知， 感染组（S）雏鸡肝脏、脾脏和肾脏上都检测到沙门菌，而益生菌组和空白对照组未检测到沙门菌。 从沙门菌检测结果来看， 应用植物乳杆菌后可有效防止鸡白痢沙门菌在机体内的侵染。

表2 脏器沙门菌数量cfu/g（×102）

2.3 肠道乳酸菌数量 从表3 可以看出，益生菌组雏鸡肠道乳酸菌数量较空白对照组和感染组分别提高3.32 倍和11.12 倍（P＜0.05），感染组雏鸡肠道中乳酸菌数量最少， 说明饲喂植物乳杆菌可增加攻毒后雏鸡肠道内乳酸菌数量。

表3 肠道乳酸菌数量cfu/g（×102）

2.4 免疫球蛋白 如表4 所示，雏鸡饲喂植物乳杆菌0410 后血清中IgG 含量增加，分别较感染组和空白对照组提高6.69%和2.03%； 血清中IgM含量较感染组降低14.63%（P＜0.05）， 较空白对照组降低0.64%（P＞0.05）；益生菌组血清中IgA含量较空白对照组提高7.08%（P＜0.05），较感染组降低4.42%（P＞0.05）。

表4 雏鸡血清中免疫球蛋白分析μg/mL

2.5 炎症因子 如表5 所示， 益生菌组血清中IFN-γ 含量较感染组升高3.94%（P＞0.05），TNFα 含量较感染组升高3.37%（P＞0.05），益生菌组血清中IL-1β 的含量较感染组降低11.29%（P＜0.05）。 益生菌组血清中IL-1β、IFN-γ 和TNF-α含量较空白对照组分别升高7.29%、11.21%（P＜0.05）和6.96%（P＞0.05）。

表5 雏鸡血清中炎症因子分析pg/mL

2.6 生化指标检测 从表6 中可以看出，益生菌组谷草转氨酶 （AST） 浓度较于感染组降低36.06%（P＜0.05），益生菌组白蛋白、球蛋白和总蛋白浓度较感染组分别提高22.75%、27.91%和24.29%（P＞0.05）。 感染鸡白痢沙门菌后AST 浓度增高， 而饲喂益生菌可使其浓度降到与空白对照组几乎相同的水平。 饲喂益生菌后可以提高感染雏鸡的蛋白水平， 而几种蛋白可以反映机体的抵抗力。 表明饲喂益生菌可以提高感染雏鸡的抗病力。

表6 生化指标检测

3 讨论

近年来的研究发现， 用益生菌制剂预防鸡白痢沙门菌有较好的效果。 用屎肠球菌J96 对肉鸡进行预处理， 可将鸡白痢沙门菌引起的死亡率从50%降低到25%（Carina 等，2000）。 感染鸡白痢沙门菌前饲喂干酪乳杆菌DBN023 可将雏鸡死亡率由24%将至8%（（Wang 等，2019））。 根据乳酸杆菌表现出的许多关键特性， 如对酸和胆汁的高耐受性、黏附肠道表面的能力、耐低pH、胃液（抗菌活性）、 抗抗生素、 产生胞外多糖和去除胆固醇（Ruiz 等，2013；Tulumoglu 等，2013）等，其对鸡白痢沙门菌应具有较好效果。 植物乳杆菌BLCC2-0410 和鸡白痢沙门氏菌CVCC533 共培养24 h的体外试验研究发现， 鸡白痢沙门菌数量降低了约3 个对数值（张甜甜等，2021）。 乳酸杆菌KL1和植物乳杆菌Zhang-LL 混合益生菌有效地降低了鸡白痢的死亡率（Chen 等，2020）。 本研究结果表明， 使用植物乳杆菌BLCC2-0410 后可降低雏鸡相对死亡率达到60.6%。

因益生菌对宿主健康的益生特性， 现在已经广泛用于防治动物疾病。乳酸菌具有的耐酸、耐胆盐特性， 可以使其在家禽胃肠道内发挥很好的作用。 如乳酸菌可以竞争性消除沙门菌在肠上皮细胞定植 （Salehizadeh 等，2020；Thirabunyanon 等，2012），保护肠道组织结构完整性，防止细菌移位而减少脏器的载菌量。本试验结果表明，饲喂植物乳杆菌BLCC2-0410 可降低雏鸡脏器载菌量，这与一些研究的结果一致。 有研究证明， 在鸡感染模型中，乳酸菌混菌处理后肝脏、脾脏中沙门菌载量降低（Yang 等，2014）。也有研究发现，植物乳杆菌WLPL01 艾草发酵液，能减少肝脏、脾脏中鼠伤寒沙门菌的数量（詹晖等，2019）。

益生菌的作用可以通过免疫系统相关基因的表达，如细胞因子表达来介导。细胞因子在宿主防御、 炎症反应和免疫介导的疾病等方面起重要作用。 TNF-α 是一种多功能细胞因子，在调节免疫反应和急性期反应时起着非常重要的作用（Akira等，1990）。IFN-γ 是细胞免疫的一个常见标志物，其含量高低与肠道感染的保护性免疫应答相关（Lee 等，2008）。 肿瘤坏死因子超家族的成员在先天免疫和适应性免疫，包括炎症、凋亡和细胞增殖中起着至关重要的作用（Kaiser 等，2014）。使用益生菌可以调节鸡沙门菌介导的细胞因子， 包括促炎细胞因子、T 辅助 （Th）1 细胞因子和Th2 细胞因子。 将三周龄鸡的微生物群转移至一日龄雏鸡的胃肠道可刺激细胞因子如IL1β、IL8、IL17、IL22和IL18 的表达（Varmuzova 等，2016）。 本试验中，饲喂植物乳杆菌BLCC2-0410 后感染白痢沙门菌雏鸡血清中炎症因子TNF-α 和IFN-γ 含量升高，而血清中炎症因子IL-1β 含量降低，这可能与饲喂植物乳杆菌BLCC2-0410 会影响感染雏鸡炎症反应有关。

在临床实践中， 通常通过测定血清免疫球蛋白含量评价机体免疫水平。 受感染的鸡可以产生三 种 主 要 的 抗 体：IgG、IgA 和IgM （Ayaz 等，2008）。本研究感染组血清中IgA 浓度高于益生菌组，这与Park 等（2017）研究结果饲粮中加入枯草芽孢杆菌（T1，T2)免疫球蛋白IgA 浓度显著提高（P< 0.05）不一致，可能与所使用菌株不同，益生菌可以减缓鸡白痢沙门菌感染后免疫球蛋白IgA的升高有关。有研究证明，乳酸菌制剂提高了鼠伤寒沙门菌感染肉仔鸡血清中IgG 和sIgA 含量（郑江平等，2020）。 本试验中植物乳杆菌BLCC2-0410 可提高感染白痢沙门菌雏鸡血清中IgG 含量与上述研究结果一致， 提示饲喂植物乳杆菌BLCC2-0410 可提高感染雏鸡的免疫功能。

血液生化指标可以反映动物机体内部代谢水平和健康状况，球蛋白（GLB）可以增强机体免疫力，白蛋白（ALB）可以维持血液胶体渗透压（孟竞尧等，2021）。 谷草转氨酶（AST）是评定动物肝脏功能的重要指标， 通常肝细胞受损会导致血液中转氨酶质量分数的升高（许金根等，2020）。益生菌可以显著影响动物血液生化指标。 枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌可显著影响不同天数断奶山羊球蛋白（GLB）、白蛋白（ALB）、谷草转氨酶（AST）及总蛋白 （TP） 等生化指标， 其中第30 天血清中AST 含量显著降低（卢佳伟等，2021）。本试验饲喂植物乳杆菌可使AST 含量显著降低，基本恢复到与空白对照组相当水平， 可有效防止鸡白痢沙门菌对肝脏的侵染。 同时有研究发现， 日粮中添加0.2%乳杆菌或酵母菌、芽孢杆菌和乳酸菌的复合微生物制剂均可提高血清中总蛋白水平（刘乃芝等，2012；赵建文，2011；刘淑娇等，2019）。 在本试验中使用植物乳杆菌BLCC2-0410 后可增加感染白痢沙门菌雏鸡血清中ALB、GLB 和TP 含量，有效提高了机体对鸡白痢沙门菌抵抗力。结果说明，植物乳杆菌BLCC2-0410 可降低白痢沙门菌对肝脏的损伤，提高雏鸡抗病能力，有效防治鸡白痢沙门菌感染。

4 结论

通过鸡白痢沙门菌感染试验和饲喂植物乳杆菌0410（BLCC2-0410）的效果评价，饲喂植物乳杆菌0410（BLCC2-0410）对防治鸡白痢沙门菌感染具有较好的作用。