Box–Behnken优化马齿苋抗氧化澄清饮料制备工艺

陈凌，骆卢佳，余蕾

Box–Behnken优化马齿苋抗氧化澄清饮料制备工艺

陈凌1，骆卢佳1，余蕾2

（1.嘉兴职业技术学院 现代农业学院，浙江 嘉兴 314036；2.浙江德馨饮料有限公司，浙江 嘉兴 314000）

比较干、鲜马齿苋的活性成分及对1,1–二苯基–2–三硝基苯肼（DPPH）的清除率，选择抗氧化活性高的马齿苋酶解液为功能原料，优化马齿苋抗氧化饮料的配方。以马齿苋酶解液、甜菊糖苷、柠檬酸为自变量，以饮料的感官评分为响应值，采用Box–Behnken响应面法优化马齿苋抗氧化澄清饮料的制备工艺。鲜马齿苋酶解液中多糖和黄酮的含量高于干马齿苋，对DPPH的清除率也大于干马齿苋。在鲜马齿苋酶解液的体积分数为45.2%、甜菊糖苷的质量浓度为0.23 g/L、柠檬酸的质量浓度为0.06 g/L等条件下，马齿苋饮料的理论感官评分值为33.2，实际评分值为33.3，表明其抗氧化能力较好（饮料的体积为0.60 mL时对DPPH的清除率为34.6%）。回归模型的预测值与实测值接近，采用响应面法优化马齿苋抗氧化饮料的工艺合理可行，制备的马齿苋抗氧化饮料呈现酒红色、澄清透明、酸甜适宜。

Box–Behnken设计；马齿苋；澄清饮料；抗氧化

马齿苋（L）属马齿苋科一年生肉质草本植物，是国家卫生和计划生育委员会认定的药食同源野生植物，它含人体所需的18种氨基酸、多种微量元素及维生素，含有生物碱、香豆精类、黄酮类、多糖、强心甙、蒽醌甙、左旋去甲肾上腺素、多巴明及多巴等[1-2]，还含有以前认为只存在于海产品中的ω–3脂肪酸。ω–3脂肪酸能使血液黏度下降，促使血管扩张，对心脏病的防治起着积极作用。马齿苋中的黄酮、多糖等活性物质具有良好的清除自由基、抗氧化、降血糖、降血脂、调节免疫机能、抗肿瘤等多种药理功能[3-6]。马齿苋具有治疗、调节、营养三大功能。目前，有关马齿苋饮料的报道主要以干制马齿苋为原料[7-8]，未见以新鲜马齿苋为原料制备饮料的相关研究。

文中以抗氧化活性高的马齿苋酶解液、甜菊糖苷（被国际上誉为“世界第三糖源”，是一种甜度高、热能低的纯天然甜味剂[9]）、柠檬酸为单因素，以对饮料的感官评分为响应值，采用Box–Behnken设计优化马齿苋抗氧化澄清饮料的工艺配方，为马齿苋产品的进一步深加工和开发提供参考。

1 实验

1.1 材料

主要材料：马齿苋（地上部分），于2019年8月采自嘉兴职业技术学院校园内；甜菊糖苷、柠檬酸，均为食品级，河南旗诺食品配料有限公司；酒精、葡萄糖、浓硫酸、苯酚、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠，均为分析纯，上海联试化工试剂有限公司；芦丁分析纯，国药集团化学试剂有限公司；果胶酶（酶活力≥50.0 U/g），国药集团化学试剂有限公司；DPPH，东京化成工业株式会社；维生素C，天津博迪化工股份有限公司。

主要仪器：DK–S24型恒温水浴锅，上海森信实验仪器有限公司；UV–1800PC紫外可见分光光度计，上海色谱仪器有限公司；ATY224分析天平，日本岛津公司；CR21N高速冷冻离心机，日本日立公司；R–210旋转蒸发器，瑞士步琪公司；JYZ–E6原汁机，九阳股份有限公司；Millipore超纯水仪、Smartpark DQ3纯水柱，美国默克密理博公司。

1.2 方法

1.2.1 干鲜马齿苋酶解液抗氧化性的比较

1.2.1.1 干鲜马齿苋酶解液的提取

将同时在同地采摘的马齿苋分为质量相等的2份，一份干制后按“Box–Behnken中心组合设计优化酶法提取马齿苋多糖的工艺”[10]提取；另一份将其鲜榨后，按“响应面法优化马齿苋多糖酶法提取工艺”[11]提取，然后比较干鲜马齿苋酶解液的抗氧化成分（主要是多糖和黄酮）的含量和抗氧化活性。

1.2.1.2 抗氧化成分的测定

干鲜马齿苋酶解液按1.2.1.1方法提取，将提取液在60 ℃下旋转蒸发浓缩后，加入4 倍体积的无水乙醇后进行醇沉，然后置于4 ℃冰箱中，放置24 h后置于冷冻离心机中离心（10 000 r/min，8 min），将沉淀物质在60 ℃下干燥，至质量恒定，即得马齿苋粗多糖。采用苯酚–硫酸法测定马齿苋酶解液中多糖的含量，采用NaNO2–Al(NO3)3法测定马齿苋酶解液中总黄酮的含量[12]。

1.2.1.3 抗氧化性的测定

采用分光光度法测定DPPH自由基的清除率[9]，清除率越大其抗氧化性越强。

1.2.2 工艺流程

工艺流程：新鲜马齿苋→杀青→榨浆→酶解→过滤→调配→混合→灌装→杀菌→冷却→成品。

操作要点：原料预处理，选择无腐烂、无病虫、无损伤的新鲜马齿苋，用自来水清洗干净，再用纯净水过1遍，沥干水分后备用；杀青，采用蒸汽杀青（5 min）钝化多酚类氧化酶的活性[13]，尽可能多地保存马齿苋中的抗氧化物质，去除马齿苋中的青草气味，为饮料品质和下一步工序奠定基础；榨浆，采用螺旋榨汁机，在压榨过程中防止或减轻空气的混入，避免损害马齿苋汁的色、香、味；酶解，用超纯水按一定的浆液比在50 ℃下用果胶酶酶解后，加热至100 ℃，保持5 min，使得酶失活，再用8层纱布过滤后得到酶解液，并将其保存于4 ℃冰箱里备用；调配，以马齿苋酶解液、甜菊糖苷、柠檬酸为单因素，以饮料的感官品质为响应值，采用响应面法优化工艺，得到最佳配方；灌装，将调配好的马齿苋饮料灌入瓶中，将瓶封口后，迅速在沸水浴中杀菌2 min。

1.2.3 感官评价

感官评价指标见表1，选择10名食品专业人员从饮料的色泽、风味、滋味和外观形态等4个方面进行感官评价，取其平均值作为最终结果。

1.2.4 单因素试验

固定柠檬酸添加量（质量浓度）为0.06 g/L、甜菊糖苷添加量（质量浓度）为0.20 g/L，在马齿苋酶解液添加量（体积分数）分别为20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%时，研究马齿苋酶解液对饮料感官品质的影响。固定马齿苋酶解液添加量（体积分数）为45%、柠檬酸的质量浓度为0.06 g/L，在甜菊糖苷添加量（质量浓度）分别为0、0.05、010、0.15、0.20、0.25 g/L时，研究甜菊糖苷对饮料感官品质的影响。固定马齿苋添加量（体积分数）为45%、甜菊糖苷的质量浓度为0.20 g/L，在柠檬酸添加量（质量浓度）分别为0、0.03、0.06、0.09、0.12、0.15 g/L时，研究柠檬酸对饮料感官品质的影响。

表1 马齿苋饮料感官评分标准

Tab.1 Sensory scoring criteria of Portulaca oleracea L. beverage

1.2.5 Box–Bnhnken试验设计

在单因素试验的基础上，以抗氧化性高的马齿苋酶解液、甜菊糖苷、柠檬酸添加量为自变量，以饮料的感官评价为响应值，采用Box–Behnken 设计响应面试验，具体因素和水平见表2。

表2 响应面分析因素与水平

Tab.2 Factors and levels of response surface methodology

1.2.6 数据统计方法

采用OriginPro 9.0 软件作图，采用Design Expert 8.0.6 软件的Box–Behnken进行试验设计和方差分析。

2 结果与分析

2.1 干鲜马齿苋酶解液抗氧化活性比较

由实验测得干马齿苋粗多糖的得率为4.88 g/kg（鲜计），鲜马齿苋粗多糖的得率为12.51 g/kg（鲜计）；干马齿苋酶解液中黄酮的得率为2.38 g/kg（鲜计），鲜马齿苋酶解液中黄酮的得率为5.45 g/kg（鲜计）。显然，鲜马齿苋酶解液中的活性成分含量远高于干马齿苋酶解液。

将干鲜马齿苋（鲜质量相同）酶解液稀释到相同体积后对DPPH的清除率见图1。由图1可知，不同体积的干鲜马齿苋酶解液对DPPH自由基均有清除作用，且随着酶解液体积的增加而增加，鲜马齿苋酶解液的抗氧化性强于干马齿苋酶解液。鲜马齿苋酶解液中黄酮的含量高于干马齿苋酶解液，这与陈莉萍等[14]的研究相符。研究还表明，鲜马齿苋对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、痢疾杆菌的抗菌效果均优于干马齿苋。由此，选用鲜马齿苋酶解液来配制马齿苋抗氧化澄清饮料，以下均采用鲜马齿苋酶解液进行响应面优化试验。

图1 干鲜马齿苋酶解液对DPPH的清除能力

2.2 单因素试验

2.2.1 马齿苋酶解液体积分数对饮料感官品质的影响

从图2可知，随着马齿苋酶解液体积分数的增加，澄清饮料的感官评分呈先增后降的趋势；当马齿苋酶解液的体积分数为45%时，饮料的感官评分相对最高，此时溶液呈亮红色，马齿苋特有的气味突出；当马齿苋酶解液体积分数继续增大时，溶液颜色会加深（粉红色的马齿苋酶解液遇到光后颜色会逐渐加深，这是由于光是花色苷生物合成的重要因子[15]），而马齿苋的酸味和涩味会加重，所以饮料的感官品质就会下降。由此，将马齿苋酶解液的体积分数确定为45%。

图2 马齿苋酶解液的体积分数对饮料感官品质的影响

2.2.2 甜菊糖苷质量浓度对饮料感官品质的影响

由图3可知，在饮料中添加甜菊糖苷有利于调整其口感，甜菊糖苷的质量浓度为0.2 g/L时，饮料的酸甜比相对最佳；在甜菊糖苷的质量浓度小于0.2 g/L时，饮料酸味偏重；在甜菊糖苷的质量浓度大于0.2 g/L时，甜度偏大，并且掩盖了马齿苋特有的味道。由此，将甜菊糖苷的质量浓度确定为0.2 g/L。

图3 甜菊糖苷的质量浓度对饮料感官品质的影响

2.2.3 柠檬酸质量浓度对饮料感官品质的影响

从图4 看出，当柠檬酸的质量浓度为0.06 g/L时，澄清饮料酸甜适宜；当柠檬酸的质量浓度大于0.06 g/L，饮料的酸度偏高；当柠檬酸的质量浓度小于0.06 g/L，饮料的甜度增高，影响了饮料的口感。由此，将柠檬酸的质量浓度确定为 0.06 g/L。

图4 柠檬酸的质量浓度对饮料感官品质的影响

2.3 响应面法优化马齿苋抗氧化饮料配方

通过Box–Behnken进行试验设计，对表3中的数据进行多元回归拟合，并对模型进行方差分析，分析结果见表4。

从表4可知，该模型显著（=0.010 4<0.05），失拟项不显著（=0.141>0.05），这说明该模型的拟合度较好，能较好地反映各因素与响应值的变化关系，可预测马齿苋抗氧化澄清饮料最佳组合的实际情况。值表明，各因素对马齿苋抗氧化饮料品质由大到小的影响顺序为甜菊糖苷质量浓度（）、柠檬酸质量浓度（）、马齿苋酶解液体积分数（）。根据回归方程做出响应面图，响应曲面越陡峭则交互作用越强。等高线的形状可反映交互效应的强弱，椭圆形表示2个因素的交互作用显著, 而圆形则与之相反。由图5—7可知，交互影响显著，得到马齿苋抗氧化饮料的二次回归方程为：=33.07+ 0.24+0.47−0.31−0.25+0.42+0.05−0.6−0.42−0.95。

2.4 验证试验

依据回归模型的数学分析，确定了马齿苋抗氧化澄清饮料的最佳配方：马齿苋酶解液的体积分数45.2%、甜菊糖苷的质量浓度0.23 g/L、柠檬酸的质量浓度0.06 g/L，感官评价预测值为33.2分。按此配方做3次平行验证试验，感官评分的平均值为33.3分，非常接近预测值，这说明该模型稳定可靠。

该配方饮料的抗氧化性能见图8。从图8可知，随着饮料添加量的增加对DPPH的清除率增大，即抗氧化性增加；当饮料的体积为0.60 mL时，对DPPH的清除率为34.6%。

表3 Box–Behnken设计方案及结果

Tab.3 Experimental design and results for Box-Behnken

表4 回归模型方差分析结果

Tab.4 Analysis of variance for the fitted regression model

注：*<0.05，差异显著；**<0.01，差异极显著。

图5 马齿苋酶解液和甜菊糖苷的含量对感官品质的影响

图6 马齿苋酶解液和柠檬酸的含量对感官品质的影响

图7 甜菊糖苷和柠檬酸的含量对感官品质的影响

图8 马齿苋饮料对DPPH的清除率

3 结语

鲜马齿苋酶解液的活性成分（主要是多糖和黄酮）含量高于干马齿苋酶解液，其抗氧化性也强于干马齿苋酶解液，因此选用鲜马齿苋酶解液来配制马齿苋抗氧化饮料。

以鲜马齿苋酶解液为原料，用Box–Bohnken试验设计优化马齿苋抗氧化澄清饮料的配方，得到相对最佳的配方：马齿苋酶解液的体积分数45.2%、甜菊糖苷的质量浓度0.23 g/L、柠檬酸的质量浓度0.06 g/L。按此配方配制的马齿苋抗氧化澄清饮料中，多糖的质量浓度为 2.40 mg/L，黄酮的质量浓度为3.86 mg/L，饮料呈现酒红色、澄清透明、酸甜适宜，具有良好的抗氧化功能。

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Optimization of Preparation Technology for Antioxidant Clarified Beverage withLby Box-Behnken

CHEN Ling1, LUO Lu-jia1, YU Lei2

(1. School of Modern Agricultural，Jiaxing Vocational and Technical College, Zhejiang Jiaxing 314036, China; 2. Zhejiang Dexin Beverage Co., Ltd., Zhejiang Jiaxing 314000, China)

The paper aims to compare the activity dry and freshL. and their DPPH scavenging rates, and select enzymatic hydrolysate ofL. with high antioxidant activity as functional raw material to optimize the formulation of antioxidant beverage ofL.. Taking enzymatic hydrolysate ofL., stevioside and citric acid as independent variables and sensory score of beverages as response value, Box-Behnken response surface methodology are used to optimize the processing technology of antioxidant clarified beverage ofL. The content of polysaccharide and flavone in the enzymatic hydrolysate of freshLis higher than that of dryL, and the clearance rate of DPPH is also higher than that of dryL.. Under the conditions of 45.2% of enzymatic hydrolysis liquid, 0.23 g/L of stevioside and 0.06 g/L of citric acid, the theoretical sensory score ofL. beverage is 33.2 points, and the actual score is 33.3 points. Its antioxidant capacity is good (the DPPH clearance rate is 34.6% when the beverage dosage is 0.60 mL). The predicted value of the regression model is close to the measured value, and the optimization of the processing technology ofL. antioxidant beverage by response surface method is reasonable and feasible. The prepared antioxidant beverage ofLis wine red, clear and transparent, and suitable for sweet and sour.

Box-Behnken design;L.; clarified beverage; antioxidant

TS275.4

A

1001-3563(2022)11-0147-07

10.19554/j.cnki.1001-3563.2022.11.019

2021–10–28

浙江省嘉兴市科技局项目（2018AY11013）

陈凌（1962—），女，嘉兴职业技术学院教授，主要研究方向为植物源食品抗氧化剂。

责任编辑：彭颋