基于PI3K/Akt/NF-κB途径探究补肾活血方治疗子宫内膜异位症的作用机制研究*

马中岭，刘鑫，汪玉凤

（青海省人民医院产科，西宁 810007）

子宫内膜异位症（EMS）是一种临床常见的妇科疾病，因子宫内膜组织发生转移、侵袭，定植在宫腔以外部位造成，患者常有痛经、不孕、月经不调、盆腔包块等症状，该病发病率高，影响着全球范围内5%～10%的育龄妇女，严重威胁着女性身体健康和生活质量[1-2]。目前，西医学临床治疗主要采用药物和手术两种疗法，长期药物疗法可能加重肝肾功能损伤，而手术切除病灶后仍具有一定的复发率，临床疗效欠佳[3]。中医认为，肾虚血瘀、肾阳不足、瘀毒阻络是诱发EMS的主要原因，因此，对于EMS的治疗，应以补肾活血、祛瘀解毒法为主，研究表明，补肾活血方（BSHXR）联合西药对EMS术后的疗效确切，可提高治疗效果，改善患者生活质量，显著减轻患者的临床症状，降低EMS的复发率，然而BSHXR对EMS的治疗作用机制尚不清楚[4-5]。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶 B（Akt）/核因子 κB（NF-κB）途径是一种密切参与到细胞生长繁殖、运动、代谢和免疫应答调节的信号通路，多在恶性肿瘤疾病中呈激活状态[6-7]。研究表明，EMS虽是良性妇科疾病，但其特点与恶性肿瘤的转移侵袭能力相似，同样，PI3K途径也与子宫内膜异位症的发病密切相关，该途径的激活可诱导血管内皮细胞生长，加速EMS的发展进程[8]。因此，本研究以PI3K/Akt/NF-κB途径为切入点，研究BSHXR对EMS大鼠的治疗作用及其作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物 SPF级SD大鼠60只，健康未孕雌性，体质量（250±20）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK（京）2016-0006]。动物饲养于青海大学医学院动物实验中心标准动物房，饲养条件：室温（22±1）℃，湿度 50%±10%，每日定时换气，保持12 h∶12 h光暗照明，自由采食、饮水。

1.2 主要试剂与仪器 BSHXR由熟地黄6 g，枫香脂 10 g，人工麝香 10 g，蛴螬 10 g，土鳖虫 10 g，五灵脂 6 g，制何草乌 6 g，乳香 10 g，虻虫 10 g，当归 6 g组成，由本院药剂科制备成含生药量2 g/mL的水煎液；PI3K抑制剂LY294002（英国Abcam公司，货号：ab120243）；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）ELISA 检测试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，货号：E-EL-R2856c、E-EL-R0012c、E-EL-R0896c）；RevertAidTMfirst Strand cDNA Synthesis Kit、SYBR Green Real-Time PCR Master Mixes（美国 Thermo scientific 公司，货号：K1621、K0252）；血小板-内皮细胞黏附分子（CD31）、磷脂酰肌醇 3-激酶（PI3K）、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（p-PI3K）、蛋白激酶 B（Akt）、磷酸化蛋白激酶 B（p-AKT）、核因子 κB（NF-κB）p65 兔单抗（美国CST 公司，货号：77699、17366、17366、4685、4060、8242）；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔免疫球蛋白 G（IgG）（IgG-HRP）（上海碧云天生物技术有限公司，货号：A0208）；双板垂直电泳仪（北京六一仪器厂，型号：DYCZ-24KS）；显微镜（日本奥林巴斯，型号：IX53）；多功能凝胶成像系统（Syngene，型号：G：BOX）；7500型PCR仪（美国AppliedBiosystems公司）；酶标仪（Thermo Fisher Scientific公司，型号：Multiskan MK3）。

1.3 实验方法

1.3.1 造模方法 参考文献方法建立EMS大鼠模型[9]：大鼠适应性喂养1周后，腹腔注射2.5%戊巴比妥钠溶液麻醉，固定、备皮、消毒，在下腹正中处打开腹腔，分离子宫，剪取右侧子宫角的部分组织并剥离子宫内膜，用活检穿孔器取2个面积为5 mm×5 mm的片段，移植于肠系膜动脉血管处，尽量远离切口。使用庆大霉素冲洗腹腔，逐层关腹，缝合切口。术后3 d内，大鼠腹腔注射0.1 mL庆大霉素防止感染。造模4周后，开腹观察大鼠移植物呈椭圆形或圆形的囊性结节，高度≥2 mm，并且表面有大量血管形成，与周围组织黏连紧密，表明造模成功，共成功造模50只大鼠。

1.3.2 分组与给药 将建模成功的EMS大鼠随机分为模型组、BSHXR高、中、低剂量组、LY294002组，每组10只，另取10只大鼠作为假手术组，仅开腹剪开子宫组织，随后缝合。造模4周后开始给药，按照人与大鼠体表面积折算等效剂量，中剂量为7.56 g/kg，高剂量为 15.12 g/kg，低剂量为 3.78 g/kg，BSHXR低、中、高剂量组大鼠按照上述剂量灌胃给药，假手术组和模型组大鼠灌胃等体积0.9%氯化钠溶液，LY294002组大鼠腹腔注射0.04g/kg的LY294002溶液，每日1次，连续28 d。

1.3.3 EMS大鼠异位子宫内膜病灶体积检测 末次给药后24 h，使用游标卡尺测量各组大鼠异位子宫内膜病灶的体积。处死大鼠后，腹主动脉取血，置于4℃冰箱中静置3 h，然后3 000 r/min，离心15 min（离心半径为12.5 cm），取上清液，用于ELISA试剂盒检测。剥离大鼠子宫，假手术组分离正常子宫内膜组织，其余各组大鼠分离异位子宫内膜组织，生理盐水清洗后取1 g用于实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）及Western blot检测，其余组织放置于4%多聚甲醛溶液固定，用于苏木精-伊红（HE）和免疫组化染色。

1.3.4 HE染色观察异位子宫内膜灶组织病理变化 将大鼠子宫内膜组织在4%多聚甲醛溶液中固定48 h后，蒸馏水清洗，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，作4 μm组织切片，二甲苯脱蜡30 min，梯度乙醇及蒸馏水中复水，HE染色，脱水、透明后中性树胶封片，光镜下观察大鼠异位子宫内膜组织病理变化。

1.3.5 ELISA法检测血清TNF-α、IL-1β和IL-6的水平 取各组大鼠血清，严格按照试剂盒说明书步骤检测 TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.3.6 免疫组化检测异位子宫内膜组织CD31表达取1.3.3中制备的组织石蜡切片，组织切片首先进行烤片、脱蜡、复水，然后抗原修复、封闭，滴加稀释的CD31兔单抗（稀释比例为1∶100），放入湿盒中4℃过夜，次日滴加羊抗兔二抗37℃孵育30 min，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗后滴加DAB显色液，苏木精染细胞核，梯度乙醇脱水，中性树胶封片，每组切片于光镜下拍摄5个视野，通过Image J软件统计获得CD31阳性细胞比率并取平均值，LSD-t检验分析不同组间CD31阳性表达差异。

1.3.7 RT-qPCR检测异位子宫内膜组织VEGF及MMP-9 mRNA水平 取大鼠异位子宫内膜组织，加入Trizol裂解液提取总RNA，使用逆转录试剂盒合成cDNA作为荧光定量模版。引物序列见表1。反应条件为：95℃预变性5 min，95℃变性30 s、62℃退火30 s、72℃延伸30 s，共40个循环，最后72℃延伸10 min，4℃5 min终止反应，实验重复3次。采用2-ΔΔCT法计算目的基因mRNA相对表达水平。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.3.8 Western blot法检测异位子宫内膜组织PI3K/Akt/NF-κB通路蛋白表达水平 取大鼠异位子宫内膜组织，研磨匀浆后加入裂解液提取组织蛋白，测定蛋白浓度，蛋白中加入loading buffer，混匀后置于沸水中煮沸5 min使蛋白变性，然后进行SDSPAGE电泳，转膜、封闭后将聚偏二氟乙烯（PVDF）膜放入各一抗稀释液中，稀释比例均为1∶1 000，4℃过夜，次日以TBST清洗后加入羊抗兔二抗（1∶2 000）37℃孵育2 h，洗膜，滴加发光液，置凝胶成像仪显影。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参蛋白，采用Image J软件分析各蛋白对应的灰度值，计算蛋白的相对表达量，蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/GAPDH蛋白灰度值。

1.4 统计学分析 应用SPSS 25.0统计软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BSHXR对EMS大鼠异位子宫内膜病灶体积的影响 结果显示，假手术组大鼠无异位的子宫内膜组织，模型组可见明显异位子宫内膜病灶形成。与模型组比较，BSHXR低、中、高剂量组大鼠及LY294002组大鼠异位子宫内膜病灶体积均减小，其中，BSHXR降低异位子宫内膜病灶体积的作用呈剂量依赖性，差异有统计学意义（P＜0.05）。BSHXR高剂量组与LY294002组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1。

图1 BSHXR对EMS大鼠异位子宫内膜体积的影响Fig.1 Effect of BSHXR on the volume of ectopic endometrium in EMS rats

2.2 EMS大鼠异位子宫内膜组织病理学观察 HE染色显示，假手术组大鼠子宫内膜组织完整，上皮细胞排列整齐、有序，细胞核较小，腺体数量和形态正常。与假手术组比较，模型组大鼠异位子宫内膜组织腺上皮细胞和基质细胞密集，细胞核较大，胞浆丰富，腺腔完整。与模型组比较，BSHXR低、中、高剂量组及LY294002组腺上皮细胞胞核体积缩小、不规则，排列松散，形态逐渐变为单层柱状，内膜腺上皮层变薄。见图2。

图2 HE染色观察各组大鼠子宫内膜组织病理学变化（HE×400）Fig.2 The histopathological changes of endometrium of rats in each group(HE staining×400)

2.3 BSHXR 对 EMS大鼠血清 TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影响 结果显示，模型组大鼠血清炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6 的水平显著高于假手术组，BSHXR低、中、高剂量组大鼠及LY294002组大鼠血清炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平均低于模型组，BSHXR各剂量组之间呈剂量依赖性，差异有统计学意义（P＜0.05）。BSHXR高剂量组炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平与 LY294002组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3。

图3 各组大鼠血清炎症因子水平比较Fig.3 Comparison of serum inflammatory factors of rats in each group

2.4 BSHXR对EMS大鼠异位子宫内膜组织CD31表达水平的影响 与假手术组比较，模型组大鼠异位子宫内膜组织中CD31阳性细胞比例显著增加，与模型组比较，BSHXR低、中、高剂量组CD31阳性细胞比例呈剂量依赖性降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。BSHXR高剂量组CD31阳性细胞比例与LY294002组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图4。

图4 各组大鼠异位子宫内膜组织CD31表达水平比较（IHC，×400）Fig.4 Comparison of CD31 expression in ectopic endometrium of rats in each group(IHC，×400)

2.5 BSHXR对EMS大鼠异位子宫内膜组织VEGF、MMP-9 mRNA水平的影响 结果显示，模型组大鼠异位子宫内膜组织VEGF、MMP-9 mRNA水平显著高于假手术组，BSHXR低、中、高剂量组VEGF、MMP-9 mRNA水平低于模型组，BSHXR各剂量组之间呈剂量依赖性，差异有统计学意义（P＜0.05）。BSHXR高剂量组VEGF、MMP-9 mRNA水平与LY294002组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图5。

图5 各组大鼠异位子宫内膜组织VEGF、MMP-9 mRNA水平比较Fig.5 Comparison of VEGF and MMP-9 mRNA levels in ectopic endometrium of rats in each group

2.6 BSHXR对EMS大鼠异位子宫内膜组织PI3K/Akt/NF-κB通路蛋白表达水平的影响 与假手术组比较，模型组大鼠PI3K、Akt磷酸化水平显著增加，胞核中NF-κB p65表达增加，胞质中NF-κB p65表达减少（P＜0.05）。与模型组比较，BSHXR 低、中、高剂量组及LY294002组PI3K、Akt磷酸化水平降低，胞核中NF-κB p65表达降低，胞质中NF-κB p65表达增加，且BSHXR的作用呈剂量依赖性（P＜0.05）。BSHXR高剂量组PI3K、Akt磷酸化水平和NF-κB p65表达与LY294002组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图6。

图6 各组大鼠异位子宫内膜组织PI3K/Akt/NF-κB通路蛋白表达水平比较Fig.6 Comparison of PI3K/Akt/NF-κB pathway protein expression levels in ectopic endometrial tissues of rats in each group

3 讨论

EMS属于临床常见的良性妇科疾病，生育期女性的发病率较高，该病症状易反复且顽固，包括痛经、性交疼痛、月经异常、不孕等，发病易累及盆腔器官甚至全身组织，不仅损害患者个人身体健康，给患者家庭及中国卫生系统也带来较大的经济负担[10-11]。EMS 属中医“癥瘕”“不孕”“月经不调”等范畴，血瘀和肾虚分别是EMS的关键病机和根本病机，血瘀和肾虚互为因果，相互影响，共同促进EMS的发生和发展[5]。已有多项研究表明，以补肾活血法治疗EMS可显著改善患者月经异常、经期腹痛等症状，降低雌激素水平，提高患者生活质量，但其具体作用机制尚不清楚[12-13]。本研究所用BSHXR由熟地黄、枫香脂、当归、制草乌、人工麝香、土鳖虫、蛴螬、五灵脂、虻虫、乳香等药材组成，具有温通补肾、活血化瘀之功效。本研究旨在通过EMS模型大鼠观察BSHXR对EMS的治疗作用，探究其作用机制。

本研究结果显示，模型组大鼠可见明显异位子宫内膜组织，病理切片显示该组大鼠异位子宫内膜组织上皮细胞排列相对整齐，细胞核增大，腺腔完整，表明造模成功。使用高、中、低剂量BSHXR治疗后，大鼠异位子宫内膜病灶体积均降低，且大鼠异位子宫内膜上皮细胞形态逐渐变为单层柱状，腺体数量和基质细胞的数量减少，表明BSHXR对EMS具有治疗作用，与既往研究结果一致[14]。研究表明，EMS的发生与腹腔免疫监视功能降低和炎症反应增加密切相关，改善机体炎症反应能够抑制异位子宫内膜病灶的生长[15]。TNF-α、IL-1β、IL-6 均是参与机体免疫应答、具有广泛免疫调节的促炎细胞因子，具有促进异位内膜及间质细胞的增殖、侵袭、转移及促进血管生成的作用，可导致盆腔局部组织黏连及纤维化，促使EMS异位子宫内膜病灶的形成[16-17]。本研究结果显示，模型组大鼠血清炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著升高，使用不同剂量BSHXR治疗后，大鼠血清中 TNF-α、IL-1β、IL-6水平均降低，表明BSHXR可减轻EMS大鼠炎症反应。

现代研究认为，EMS的发生发展均涉及细胞的黏附、侵袭和血管形成过程，因此，抑制细胞异常的黏附、侵袭和血管形成过程已成为预防EMS的关键[18]。MMPs和VEGF是异位子宫内膜在盆腔病变的关键因子，其中，MMP-9是基质金属蛋白酶家族中活性最强的一员，可降解细胞外基质成分，促进EMS的侵袭和血管形成过程，而EMS患者MMP-9基因的表达水平也往往呈异常增高的状态，该基因的水平可作为评估EMS严重程度的指标[19]。VEGF是一种强效特异性血管生成因子，可直接作用于内皮细胞而促进血管新生，加快在位子宫内膜异常转移及异位子宫内膜的增生[20]。CD31是内皮细胞特异性标志物，常用于反映血管生成情况[21]。本研究结果显示，模型组大鼠异位子宫内膜组织CD31阳性细胞比例升高，VEGF、MMP-9 mRNA水平亦显著升高，使用BSHXR低、中、高剂量治疗后，大鼠异位子宫内膜组织中CD31阳性细胞比例和VEGF、MMP-9 mRNA水平均降低，表明BSHXR治疗EMS的机制之一可能是抑制CD31、VEGF及MMP-9的表达，抑制EMS黏附、侵袭和血管形成过程。

PI3K/Akt/NF-κB信号通路是一种密切参与到细胞生长繁殖、运动、代谢和免疫应答调节的信号通路，几乎所有人类和动物肿瘤疾病中均发现了其被活化的现象[22]。PI3K是生长因子受体超家族信号传导途径的关键分子，可被生长因子、细胞因子和激素与受体酪氨酸激酶和G蛋白偶联受体结合而激活，激活后的PI3K可进一步活化下游的Akt，而PI3K/Akt通路的表达改变会影响IκB的表达水平，由于IκB是NF-κB的抑制性因子，因此当IκB被抑制后可促进NF-κB的活化，并进一步引起炎症因子释放[23-24]。研究表明，PI3K相关信号转导途径在EMS中发挥重要作用，抑制该信号通路的活化可改善大鼠EMS相关症状[25]。在本研究中，模型组大鼠PI3K、Akt磷酸化水平显著增加，NF-κB p65转移入核水平增加，使用BSHXR低、中、高剂量治疗后，大鼠异位子宫内膜中PI3K、Akt磷酸化水平降低，NF-κBp65入核减少。为了进一步探究BSHXR治疗EMS的作用机制，本研究同时使用了PI3K抑制剂LY294002。LY294002是PI3K的选择性抑制剂，可阻断该通路上部分基因和蛋白表达，有研究表明，LY294002可通过抑制PI3K通路对EMS动物产生治疗作用，抑制上皮间质细胞的活性，促进细胞凋亡[26-27]。与上述研究结果一致，本研究结果显示，LY294002对EMS大鼠的治疗作用与BSHXR高剂量组比较，差异无统计学意义（P>0.05），提示BSHXR对EMS的治疗作用可能是通过抑制PI3K/Akt/NF-κB信号通路活化产生的。

综上所述，BSHXR可抑制PI3K/Akt/NF-κB信号通路的活化，缩小异位子宫内膜病灶体积，改善异位子宫内膜病理学变化，抑制炎症反应及血管新生过程，下调VEGF和MMP-9的表达。本研究初步揭示了BSHXR治疗EMS的作用机制，但EMS是一种多因素疾病，病机复杂，其疗效及作用机制仍需进一步结合体外实验及临床研究加以阐明。