《中华人民共和国药典》2020年版中防己薄层色谱鉴别研究

曹朴琼，陶明宝，杨深应，赵 霞，陈 琪，顾小迪

(1.保山市食品药品检验检测中心，云南 保山 678000；2.保山中医药高等专科学校，云南 保山 678000)

防己为防己科粉防己(StephaniatetrandraS.Moore)的干燥根，具有祛风止痛、利水消肿的功效，用于风湿痹痛、水肿脚气、小便不利、湿疹疮毒[1]。其主要化学成分为生物碱类，包括粉防己碱、防己诺林碱、轮环藤酸碱等[2-3]。《中华人民共和国药典》2020年版防己标准中鉴别(2)项下的薄层色谱鉴别以防己诺林碱、粉防己碱为对照，缺乏对照药材对照，同时使用的展开剂中含有易制毒化学物三氯甲烷。三氯甲烷对检测人员具有较大的危害，且受公安部管制，试剂获得比较困难，宜进行优化。本次实验研究是在药典标准上，查阅相关文献[4-8]，对防己薄层色谱方法进行优化，增加防己对照药材对照，去除三氯甲烷有毒物质，采用硅胶GF254薄层板直接在紫外光灯(254 nm)下检视，不喷显色剂，简化显色程序，凸显了薄层色谱法准确、快速、廉价、专属性强的特点，为防己薄层色谱鉴别的进一步完善提供参考依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

赛多利斯CP225D电子天平(德国赛多利斯公司)，硅胶G薄层板、硅胶GF254薄层板(青岛海洋化工、烟台市化学工业研究所)。

1.2 试药

防己对照药材(批号：121279-201502 )、防己诺林碱对照品(批号：110793-201807)、粉防己碱对照品(批号：110711-201609)，均购自中国食品药品检定研究院；防己样品,均来自云南省药品评价抽检专项(样品A，产地江西，批号：190901；样品B，产地江西，批号：190901；样品C，产地江西，批号：20120703；样品D，产地浙江，批号：180303；样品E，产地江西吉安，批号：190701；样品F，产地河南，批号：2103002；样品G，产地江西，批号：20190601；样品H，产地安徽，批号：190401)；甲醇、乙醇、乙酸乙酯等试剂，均为分析纯(天津市风船化学试剂科技有限公司)，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 《中华人民共和国药典》2020年版一部方法

《中华人民共和国药典》2020年版一部[1]防己【鉴别】(2)：取本品粉末 1 g，加乙醇 15 mL,加热回流 1 h，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇 5 mL 使溶解，作为供试品溶液。另取粉防己碱对照品、防已诺林碱对照品，加三氯甲烷分别制成 1 mg/mL 的混合溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述两种溶液各 5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-丙酮-甲醇-5%浓氨试液(体积比6∶1∶1∶0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液,置日光下检视。薄层色谱图见图1。

1.粉防己碱、防己诺林碱混合对照；3～6.供试品：A、B、C、D

2.2 改进方法

取本品粉末 1 g，加2%盐酸甲醇溶液 15 mL，加热回流 1 h，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇 5 mL 使溶解，作为供试品溶液。另取防己对照药材 1 g，同法制成对照药材溶液。再取粉防己碱对照品、防已诺林碱对照品，加乙醇分别制成 1 mg/mL的混合溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述两种溶液各 5 μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲醇-5%浓氨试液(体积比7∶1∶0.7∶0.3)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯(254 nm)下检视。薄层色谱图见图2。

1. 粉防己碱、防己诺林碱混合对照； 2. 防己对照药材； 3～10. 供试品：A、B、C、D、E、F、G、H。

2.3 方法学考察

对薄层色谱鉴别方法进行耐用性考察。考察不同温度、湿度和不同薄层板等影响因素，确保方法的可靠性。

2.3.1 不同温度的考察

取薄层板点样，分别在 4 ℃(a)和室温 26 ℃(b)下展开显色检视，结果见图3。结果表明，在室温 26 ℃ 条件下展开较好。

2.3.2 不同湿度的考察

取供试品与对照药材、混合对照品溶液，按“2.2”项下方法，在室温条件下，分别在环境湿度相对湿度为43%(c)、75%(d)的条件下分别展开，结果如图3。结果表明，不同湿度条件下，各斑点分离度均满足要求。

2.3.3 不同品牌的薄层板考察

取本品，分别在硅胶GF254薄层板(青岛海洋化工)(e)与硅胶GF254薄层板(烟台市化学工业研究所)(f)的薄层板点样，展开，结果见图3。结果表明，不同薄层板上主斑点均能较好分离，但青岛海洋化工薄层板上各主斑点更清晰，优选青岛海洋化工硅胶GF254薄层板。

a.4 ℃；b.26 ℃；c.相对湿度为43%；d.相对湿度为75%；e.硅胶GF254薄板层(青岛海洋化工);f.硅胶GF254薄板层(烟台市化学工业研究所)。

2.4 供试品色谱图

吸取供试品溶液和对照药材溶液、混合对照品溶液各 5 μL，按“2.2”项下方法点于同一青岛硅胶GF254薄层板上，结果见图2。结果表明，此方法分离度好，较原标准中显色斑点多，可用于防己鉴别。

3 讨论

3.1 提取溶剂考察

考察了甲醇、乙醇、2%盐酸甲醇[1]，发现防己对照药材用甲醇、乙醇提取液，斑点颜色较浅；用2%盐酸甲醇提取液，斑点颜色较深。故选择2%盐酸甲醇作为提取溶剂。

3.2 提取方法考察

以2%盐酸甲醇为提取溶剂，考察回流 1 h、回流 30 min、超声 1 h、超声 30 min，发现4种提取方法对防己诺林碱和粉防己碱没有显著差异，但其余2个斑点在回流 1 h 条件下斑点更清晰，故选择加热回流 1 h 作为提取方法。

3.3 点样量考察

分别对 3 μL、4 μL、5 μL、6 μL、7 μL 点样量进行了考察，结果表明，4 μL 和 5 μL 点样量斑点较清晰，6 μL、7 μL 存在不同程度的拖尾， 故采用 5 μL 为点样量。

3.4 展开剂及薄层板的考察

结合参考文献[4-8]，考察了展开剂——三氯甲烷-丙酮-甲醇-5%氨水(体积比6∶1∶1∶0.1)系统、正丁醇-丙酮-甲醇-5%氨水(体积比6∶1∶1∶0.1)系统、乙酸乙酯-丙酮-甲醇-5%氨水(体积比7∶1∶0.7∶0.3)系统，薄层板——硅胶G和硅胶GF254。结果表明，三氯甲烷系统检视斑点较少，正丁醇系统拖尾，乙酸乙酯系统斑点数最多，也最明显，且分离度好 。试验中发现，5%氨水对斑点的Rf值影响较大，故考察了氨水的不同浓度及用量，结果发现：用乙酸乙酯-丙酮-甲醇-5%氨水(体积比7∶1∶0.7∶0.3)时，分离效果最好。考察了硅胶G板展开后喷显色剂和硅胶GF254板直接看荧光，发现：硅胶G板除粉防己碱和防己诺林碱斑点比较明显外，其余斑点显色不清楚，而GF254板能呈现较好的4个斑点，故选择硅胶GF254板，置紫外光灯(254 nm)下检视。

3.5 药典方法和改进后方法的对比

药典方法只用粉防己碱和防己诺林碱作为对照，无对照药材对照，不能全面反映药材质量。改进后方法增加了对照药材对照，供试品在与对照药材色谱相应位置上，能展现较明显的4个斑点，显示出更多鉴别信息；在展开剂组分方面，药典法展开剂中含有毒性较大的易制毒化学品三氯甲烷，本试验把三氯甲烷换为乙酸乙酯，毒性较低且还能展现更多的化学成分，混合对照品的溶剂三氯甲烷也换成毒性较小的乙醇，在日常检验过程中降低对实验人员的危害。

4 结论

该方法专属性强，分离度好，检视简便，可为防己质量标准提高完善提供参考。