多种BOD5专用接种液接种效果的比对分析

周丽珍，黄 成，丁炜炜

(广东省韶关生态环境监测中心站， 广东 韶关 512000)

随着社会和工业的发展，越来越多的有机污染物排入水体中。五日生化需氧量(Five-day biochemical oxygen demand简称BOD5)是指水样充满在密闭水封的溶解氧瓶中，在(20±1)℃恒温下暗处培养5 d，然后分别测量第一天和第五天水样中溶解氧浓度差，即为BOD5值[1-2]。BOD5作为综合反映有机污染物污染情况的一项重要指标，能相对表示微生物可氧化有机污染物的含量。因此BOD5是环境监测领域必测指标，也是污水治理领域重要的污染控制指标[3-4]。目前，分析测试BOD5的方法主要包括：稀释接种法、无汞差压法、微生物传感器法、活性污泥曝气降解法和重铬酸钾紫外光度法等[5]。在所有的分析方法中，稀释接种法，即《水质 五日生化需氧量(BOD5)的测定稀释与接种法》(HJ505-2009)是BOD5监测的经典方法，也是环境监测系统内仲裁分析、能力验证、比对考核、采测分离等工作采用的方法[1,6]。因此本文采用稀释接种法进行BOD5分析测试工作。稀释接种法实验过程，实际上就是微生物氧化分解有机物并消耗氧气的过程。对于不含微生物或微生物含量较小的样品，如高温废水、灭菌出口水或者标准样品等，均需要接种外界微生物，来对有机物进行分解。因此接种液是分析BOD5的技术关键[7-8]。许雪莹[9]、王兴力[10]研究了土壤浸出溶液、洗米水、生活污水、废水和经过驯化微生物的废水，分别作为接种液，对BOD5标准溶液进行测试，发现，导致BOD5测试结果不稳定的因素之一就是接种液中微生物的种类和数量不确定性。Fitzmauric G. D[11]、Itsusei Fujita[12]采用已知微生物种类和数量的标准化混合菌株对BOD5标准溶液进行测试，结果均合格，而且数据结果的精密度和稳定性均比江河湖水等非标准菌株接种液有显著提升。为此，本实验室对5种不同接种液(自行培养的污泥菌种、污水厂未灭菌出口水、某研究所BOD5专用接种液、EM 菌种和哈希菌种)进行实验分析，以期找到一种稳定、高效且具有一定推广性的接种液，从而大大提高BOD5实验效率和成功率。

1 接种液来源与前处理

本实验室使用的5种接种液如下：

1)本实验室自行培养的污泥菌种：具体配置方法和前处理见文献[13] ；2)污水厂未灭菌出口水：取韶关市某污水厂沉淀池之后出水口之前环节，即进入灭菌工序之前的污水，可直接作为接种液使用。使用时，按照1 L稀释水中加入20 mL污水厂未灭菌出口水的比例进行接种。3)某研究所BOD5专用接种液(以下简称某研究所BOD5接种液)：取土壤 100 g，加入1 L纯水，混合搅拌，静置 10 min；取上清液10 mL，用纯水稀释至1 L。使用时按照1 L稀释水中加入 4 mL 接种液的比例进行接种；4) EM菌种：主要成分为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和酵母菌等多种益生菌、酶制剂及微量元素，可直接在市场购买作为接种液使用。使用时，按照1 L稀释水中加入0.5 mL EM菌种的比例进行接种。5) 哈希菌种(POLYSEED)：该菌种为一种广谱细菌的混合物，产自美国，可直接在市场购买。

哈希菌种前处理方法：一颗胶囊打开，倒入1 L烧杯中，再倒入500 mL已恒温到20℃纯水，之后边搅拌边按照1 mL/L比例分别加入稀释接种法中硫酸镁、氯化钙、氯化铁和磷酸盐缓冲溶液[1]。加入搅棒子，放于磁力搅拌器上，1 L烧杯和磁力搅拌器均放入恒温培养箱中，然后进行曝气1 h。曝气后静置 0.5 h ,然后倒出上清液于棕色广口瓶，并放置于4℃冰箱保存。使用时，按照1 L稀释水中加入20 mL接种液的比例进行接种。

2 实验器材和步骤

2.1 实验器材

溶解氧分析仪：产自德国，型号YSI 4010-1W；恒温培养箱：国产，型号DWRH-500P，使用温度(20±1)℃；溶解氧瓶：带水封装置，容积 250～300 mL；稀释容器：1000 mL 的容量瓶；稀释水配置容器：10 L白色塑料罐，自带水龙头和出水口橡胶管；曝气装置：多通道氧气泵。

2.2 实验步骤

1)纯水恒温：用白色塑料桶接一定量的纯水，放置在恒温培养箱恒温到20℃；

2)配置稀释水：使用前控制初始溶解氧质量分数大于8 mg/L。若初始溶解氧质量分数低于8 mg/L时，可以通过曝气几分钟来提高溶解氧含量；若初始溶解氧过饱和时，可以使用热得快加热几分钟赶出过饱和溶解氧即可。之后，边搅拌边按照1 mL/L比例分别加入稀释接种法中硫酸镁、氯化钙、氯化铁和磷酸盐缓冲溶液四种营养液。

3)稀释接种标准样品：测CODcr值，结合稀释接种法中推荐的比例，确定稀释倍数。在1 L容量瓶中稀释接种后，分装到带水封装置的溶解氧瓶中。

4)测量培养前和培养后的溶解氧含量：预热并校准溶解氧仪，探头插入溶解氧瓶中，测量数据，计算BOD5值。

3 结果与讨论

3.1 筛选接种液

为避免水样中不确定因素的干扰，本实验采用5种不同接种液均对相对低、中、高浓度的标准样品(环保部的)进行接种测试。相对低、中、高浓度的标样分别为编号200249(30.7±4.7 mg/L)、编号200253(82.3±5.9 mg/L)和编号200260(114±8 mg/L)。同时，每种接种液类型均分析了两个接种比例。结果见表1～表3

表1 环保部BOD5标准样品200249 (30.7±4.7 mg/L) 测试结果

由表1～表3可知，某研究所BOD5接种液分别测试质量浓度为30.7±4.7 mg/L、82.3±5.9 mg/L和114±8 mg/L的环保部的标准样品均不合格，测试结果均偏低，且随着标准样品浓度越高，偏离合格范围越远；EM 菌种对三种浓度标样测试结果也是偏低，且也是随着标准样品浓度越高，偏离合格范围越远；自行培养的污泥菌种、污水厂未灭菌出口水和哈希菌种对三种标准样品测试结果均在合格范围内，且相对标准偏差在0.9%～2.5%范围内。稀释接种法中，对于缺少微生物的试样中，接种液的质量是影响BOD5准确度的重要因素[14]，而接种液的质量主要包括接种液中微生物的种类、活性和量。本实验中，5种接种液均采用了两个梯度的接种量，每种接种液的两个梯度接种量测试BOD5结果均接近，因此推测在本次实验中接种液的接种量不是影响接种效果的主要因素，接种液中微生物的种类和活性是才是接种效果的决定因素。当接种液中微生物种类结构对营养物质缺乏分解能力或者微生物活性不够时，则无法分解营养物质消耗溶解氧，导致结果偏低。尤其是，使用的标准样品的浓度越高，对微生物活性需求就越高，测试结果就可能出现偏低程度越大的情况。例如，某研究所BOD5专用接种液和EM菌的数据。因此，本次接种液筛选出的有效菌种为自行培养的污泥菌种、污水厂未灭菌出口水和哈希菌种，无效菌种为某研究所BOD5专用接种液和EM 菌种。

表2 环保部BOD5标准样品200253 (82.3±5.9mg/L) 测试结果

表3 环保部BOD5标准样品200260(114±8mg/L) 测试结果

3.2 筛选出的有效接种液接种废水效果

采用以上筛选出的三种有效菌种(自行培养的污泥菌种、污水厂未灭菌出口水和哈希菌种)对韶关市某生活污水处理厂的进口废水进行接种，初步探索各菌种接种后对污水厂进口废水BOD5分析测试效果。结果见表4。

表4显示，3种接种液的实验室空白均小于1.5 mg/L，符合方法要求;BOD5测试质量浓度范围在69.4～73.0 mg/L,总平均值为71.5 mg/L，总相对标准偏差为1.8%，说明3种不同接种液接种后，污水厂进口废水的BOD5值相差不大。哈希菌种接种后废水的BOD5测试相对偏差为0.8%，低于自行培养的污泥菌种和污水厂未灭菌出口水接种后的相对偏差，说明哈希菌种接种后韶关市某污水处理厂进口废水BOD5测试数据的稳定性和精密度均要高于自行培养的污泥菌种和污水厂未灭菌出口水接种液。

表4 韶关市某污水处理厂进口废水BOD5测试结果

3.3 有效接种液优缺点对比

自行培养的污泥菌种是本实验室对活性污泥持续进行培养得到的,优点在于培养地点在实验室环境内，可以随用随取，使用方便，而且菌种浓度和种类在一段时间内相对稳定，因此接种量相对固定。然而在有限的空间和营养物质的条件下，自行培养的污泥菌种虽然能自行繁殖，不断更新换代，但是存在寿命限制，通常只能培养并使用一段时间就需要更换污泥。其次，培养污泥菌种需持续曝气并每天供应营养琼脂，在一定程度上，也增加实验人员的工作量。

污水厂未灭菌出口水是直接从污水厂沉淀池的出口接取的水。该水取回即可进行接种，直接测试BOD5，无需再进行前处理，使用方便，但是每次实验前均需外出污水厂取水，需要较大的人力物力，且随着污水厂进口水质的浓度不同以及下雨等不可控因素，每次污水厂未灭菌出口水的菌种浓度有所变化，因此在一定程度上会影响菌种接种量，从而影响BOD5的成功率。

哈希菌种实际上是菌种制成的冻干粉，保存时间可以长达2年。每次使用前只需将冻干菌种按照以上操作步骤进行活化，活化后即可直接进行接种。该菌种的浓度和种类都是固定的，因此接种量不受菌种本身影响。相比于自行培养的污泥菌种和污水厂未灭菌出口水，哈希菌种保存时间长，菌种稳定性好，浓度和种类均不受时间和外界因素影响，可以随用随取，操作简单，不用增加额外的人力物力，同时，方便携带，具有一定的推广性和复制性，在一定程度上可作为同行实验人员测试BOD5优先考虑的接种液对象。

4 结论

本实验室使用5种不同接种液(自行培养的污泥菌种、污水厂未灭菌出口水、某研究所BOD5专用接种液、EM 菌种和哈希菌种)测试BOD5，得到有效接种液有三种，分别为自行培养的污泥菌种、污水厂未灭菌出口水和哈希菌种，无效菌种为某研究所BOD5专用接种液和EM 菌种。使用筛选出的三种有效接种液对相对低、中、高浓度的环保部的标准样品和某污水处理厂进口废水进行接种并测试BOD5，结果显示，在所有接种液中，哈希菌种是相对更高效、稳定和便捷性的接种液，且具有一定的推广性，建议作为同行实验人员测试BOD5可优先考虑的接种液。