施用生物炭对黑土各组分有机质结构的影响

龙杰琦，苗淑杰，李 娜，郝翔翔，乔云发*

（1 南京信息工程大学应用气象学院，江苏南京 210044；2 中国科学院东北地理与农业生态研究所，黑龙江哈尔滨 150081）

土壤有机质(soil organic matter, SOM)作为土壤的关键组成部分，是影响土壤肥力的决定因子[1]，是促进土壤发育和提高土壤功能的最原始且最核心的驱动者,在土壤质量和农业生产力的可持续性方面具有重要的作用[2-3]。SOM是动态变化的，并由不同组分构成，组分的分子结构特征直接影响土壤有机质的稳定性[4]。为了更深入探究有机质结构的变化规律，通常把SOM分为化学分级和物理分级，但因后者在分组过程对SOM破坏性小，更能有效反映有机质的结构特征，故其成为研究SOM组分的重要手段[5]。土壤有机质物理分级主要依据土壤密度、颗粒大小、空间分布等进行分类[2]，根据密度大小将有机质分为游离态轻组(free light fraction, LF)、闭蓄态轻组(occluded light fraction, OF)和矿物结合态组分(mineral-associated fraction, MF)[6-7]，根据团聚体粒级将有机质筛分为>2 mm、2～0.25 mm、0.25～0.053 mm和<0.053 mm团聚体有机质[8]。SOM在土壤中的功能与其化学结构密切相关，不同粒径团聚体内的有机质组分和化学结构存在差异[9]。土壤有机质的组分和结构决定了其稳定性，有机质的稳定性与其含量密切相关，而维持和提升农田土壤有机质含量的关键就是输入外源有机物质[3]。

我国作物秸秆资源丰富，秸秆还田是培肥地力最为普遍的农艺措施，能有效提升土壤质量，维持其可持续生产力。东北黑土地区气候寒冷，秸秆还田后不易腐解，降低作物出苗率，而将秸秆制备成生物炭(biochar)施入土壤后其可以通过对腐殖质及微域特征的影响来促进碳素固定，增加土壤有机碳含量。由于生物炭具有较大的比表面积、高度芳香化碳结构和发达孔隙结构等特性[10-12]，能提高土壤有机质含量和改善土壤理化性质，所以近年来生物炭作为一种土壤改良剂在农业领域内被广泛应用。高尚志等[13]研究发现，生物炭可促进土壤团聚体对有机碳的物理化学保护，对土壤有机碳的稳定性增强、含量提升以及促进碳封存都具有积极的影响。李江舟等[14]对云南烟区红壤的研究结果表明，生物炭对土壤有机碳的作用过程是持续的,连续施用生物炭在改善土壤物理性状的同时,也有利于稳定增加土壤碳汇。因此，本研究将土壤团聚体和密度分组的有机质含量与红外光谱特征相结合，揭示生物炭对土壤有机质含量动态变化和稳定性机制的影响。

红外光谱技术(fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)是一种利用物质有机官能团如C−H、O−H、N−H等对红外光的选择性吸收来进行分子结构分析的技术，通过物质的特征红外吸收光谱进行定性和定量分析，可有效反映土壤中官能团特性和结构变化的方法[15-17]，应用红外光谱技术研究土壤有机质的化学组成和结构也是近年来的热点之一。常汉达等[18]采用FTIR研究弃耕地开垦前后不同土层土壤有机质红外光谱特征，发现开垦后土壤有机质结构更为复杂，且芳香族官能团所占比例的提高是土壤有机质结构稳定性提高的重要原因。Demyan等[19]采集了施用不同肥料处理5年的土壤，发现在红外光谱波长1620 cm−1处芳香族结构和2930 cm−1处脂肪族结构吸收峰面积的比值与有机碳含量的比值呈显著正相关，可作为SOM稳定性指标。前人对SOM的组分与结构的研究集中在短期内，有机质含量波动较小，生物炭对黑土SOM长期动态变化影响的研究还鲜有报道。

东北黑土区是我国重要的土壤有机碳储库(有机碳储量为C 12.6 Pg)，但近年来，东北黑土有机质含量呈下降趋势[20]，土壤肥力降低威胁国家粮食安全。因此，本研究依托施用生物炭9年的长期定位试验平台，利用红外光谱分析技术，以土壤团聚体有机质组分和密度组分的有机质分子结构为切入点，对比分析施用与未施用生物炭的土壤有机质红外光谱特征，探讨生物炭对黑土有机质组分和结构特征的影响，揭示生物炭对黑土有机质的动态变化影响规律，为进一步利用生物炭提高农田土壤固碳潜力提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

试验布设在中国科学院海伦农业生态实验站(47°27'19.83″N，126°55'49.31″E)，位于黑龙江省松嫩平原腹地黑土中心地带，该区属于中温带大陆性季风气候，冬季寒冷干燥，夏季高温多雨，雨热同期，年均降水量550 mm，平均蒸发量2300 mm，年均气温1.5℃，全年有效积温(≥10℃) 2450℃，无霜期125天，海拔约210 m，地势平坦[21]。供试土壤为黑土，pH为7.02，母质为第四纪黄土。试验初始时土壤有机质51.96 g/kg、全氮2.32 g/kg、全磷1.67 g/kg。

1.2 试验设计

选取2011年中国科学院海伦农业生态实验站建立的生物炭还田长期定位试验的2个处理：传统农田施化肥(−BC)和传统农田施化肥配施生物炭(+BC)，每个处理3次重复，小区面积为12 m2(4 m×3 m)。氮磷钾施肥量为N 174 kg/hm2、P2O540.2 kg/hm2和K2O 44.8 kg/hm2，2011年试验开始时一次性施用玉米秸秆烧制成粉末状生物炭12000 kg/hm2，其施用量为耕层0—20 cm土壤全碳储量的15%，施入0—20 cm的耕层土壤充分混匀，田间管理与当地农业生产相一致。

1.3 土壤样品采集

2019年10月1 日采集土样，取0—20 cm的耕层土样，每个小区采用“S”形多点采集。带回实验室后，阴干过程中沿土壤结构的自然纹理掰分成小团块，去除杂质保留生物炭颗粒。

1.4 测定方法

土壤水稳性团聚体筛分：采用Yoder湿筛法[22]，套筛孔径依次为2、0.25和0.053 mm。将土样浸润糊化10 min后倒入套筛，团聚体分析仪上下筛分频率为20 r/min，筛分10 min。筛分结束后，用蒸馏水冲洗套筛上的各级团聚体至已称重烧杯里，65℃下烘干至恒重。分离出 > 2 mm、2～0.25 mm、0.25～0.053 mm和 < 0.053 mm 粒级团聚体。

有机质密度分组[23]：1)称取10.00 g土样装入离心管中，加入50 mL的碘化钠重液(d=1.7 g/cm3)，混匀后在3500 r/min离心15 min。用吸管吸出上清液，经0.45 μm滤膜过滤，用CaCl20.01 mol/L溶液和蒸馏水洗涤吸管和滤膜，滤膜及滤膜上残留物全部转移至已称重烧杯中，40℃烘干称重，这一组分即为游离态轻组(free light fraction, LF)。2)离心管里的沉淀加50 mL碘化钠，进行超声波破碎15 min(40 Hz，100 W)后再离心，同样方法取上清液、过滤、洗涤、烘干即得到闭蓄态轻组(occluded light fraction, OF)。3)离心管内沉淀加50 mL蒸馏水，振荡20 min，4000 r/min离心20 min，倒出上清液，重复洗沉淀3次，然后再用95%乙醇反复洗涤至无色，转移至已称重烧杯中，40℃烘干后称重，这一组分即矿物结合态组分(mineral-associated fraction, MF)。

有机碳测定：将全土、各粒级团聚体和各组分研磨过0.25 mm筛，用元素分析仪(Vario EL III)测定，供试土壤无碳酸盐反应。

有机质含量换算公式如下：

傅里叶红外光谱测定[24]：称取土样0.7 mg和70 mg溴化钾于玛瑙研钵中混匀，用压片机制作压片，用傅里叶红外光谱仪(Nicolet-6700型)测定其红外透射光谱，光谱的测量范围为4000～400 cm-1，分辨率为4 cm-1，扫描次数为16次。

1.5 数据分析

采用Excel 2010软件整理数据，SPSS 21.0软件进行t检验，设置显著性P0.05，用Origin 8.0绘制图和主成分分析，Ommic Version 8.0处理红外光谱图。

2 结果与分析

2.1 生物炭对团聚体和各密度组分有机质含量的影响

图1显示，相同处理中不同粒径团聚体有机质含量随粒径减小呈现先升高后降低的变化规律，其中各处理2～0.25 mm粒级团聚体中有机质含量最高，为58.39～70.86 g/kg，<0.053 mm团聚体中含量较低，为50.86～61.37 g/kg。与-BC处理相比，+BC处理的土壤有机质增加了19.72%，>2 mm和2～0.25 mm粒级中的有机质含量分别增加了12.54%和21.35%，在<0.25 mm粒级中的增加量不显著。

图1 全土及其各粒级团聚体中的有机质含量Fig. 1 The concentrations of soil organic matter in bulk soil and aggregate fraction

图2显示，有机质含量OF组分>LF组分>MF组分。+BC处理的各密度组分中有机质含量变化幅度不同，LF组分中增加了73.50%，OF组分中增加了192.66%，而MF组分中有机质含量无显著变化。这表明施用生物炭主要增加了>0.25 mm粒级大团聚体中的有机质含量，增加的有机质主要为LF和OF组分。

图2 密度组分中的有机质含量Fig. 2 The concentrations of soil organic matter in density fractions

2.2 有机质红外光谱特征

全土、各粒级团聚体和密度组分红外光谱测定结果(图3和图4)表明，−BC和+BC处理下土壤及其各粒级团聚体中的有机质光谱图的吸收峰相似，主要包括 3620 cm−1(自由醇酚−OH)、3417 cm−1(缔合醇酚−OH)、2934 cm−1(不对称脂肪族−CH)、2853 cm−1(对称脂肪族−CH)、1631 cm−1(芳香族 C=C)、1720 cm−1(羰基 C=O)和 1030 cm−1(多糖 C−O) 7 个吸收峰[25-26]。与土壤红外特征峰相比，3个有机质密度组分的主要吸收峰是3614 cm−1(自由醇酚−OH)、3391 cm−1(缔合醇酚−OH)、2923 cm−1(不对称脂肪族−CH)、2851 cm−1(对称脂肪族−CH)、1631 cm−1(芳香族C=C)和1033 cm−1(多糖C−O) 6个特征峰，除了共有特征峰外，OF组分中出现吸收峰1384 cm−1(甲基−CH3)，MF组分出现吸收峰 1720 cm−1(羰基C=O)。−BC和+BC处理3个密度组分的特征峰相似，仅相对峰面积有变化，说明生物炭没有影响密度组分有机质特征结构，但影响了有机结构的相对丰度。

图3 全土及其各粒级团聚体有机质红外光谱Fig. 3 Infrared spectrum of organic matter in all aggregates and bulk

图4 密度组分有机质红外光谱Fig. 4 Infrared spectrum of organic matter in density fractions

2.3 全土及其各粒级团聚体中有机质红外光谱特征

红外特征峰相对丰度表示相应基团和物质含量，本试验将自由−OH和缔合−OH的加和代表醇酚−OH，脂肪族对称和不对称−CH加和代表脂肪族−CH，采用Ommic软件对各吸收峰进行积分，计算某一峰的面积占特征峰面积的百分比，即所对应的官能团相对丰度[10]。由表1可知，同一处理中，不同粒级中的基团相对丰度不同，多糖C−O伸缩振动最强，其次是醇酚−OH、芳香族C=C和脂肪族−CH，羰基C=O伸缩振动最弱。与−BC处理相比，+BC处理土壤的芳香族C=C和羰基C=O相对丰度减少，其余5个官能团相对丰度均增加，且脂肪族−CH增幅最大，增加了30.64%，芳香族C=C和羰基C=O相对丰度分别减少了18.18%和21.95%，−CH/C=C与−CH/C=O值均增大，分别增加66.67%和62.11%。生物炭对团聚体不同粒级中的基团相对丰度影响也不同，与−BC处理相比，在>2 mm粒级中，+BC处理的醇酚−OH和脂肪族−CH的相对丰度分别增加了7.68%和55.11%，芳香族C=C和羰基C=O分别减少了17.06%和26.67%，多糖C−O降幅较低，−CH/C=C和−CH/C=O值增幅分别达78.57%和91.25%；2～0.25 mm粒级中，+BC处理的醇酚−OH增辐较小，其余官能团丰度均减少，其中芳香族C=C减少了27.15%，羰基C=O和多糖C−O分别减少17.5%和14.36%，−CH/C=C和−CH/C=O值增大。在<0.25 mm粒级的+BC处理中，除了芳香族C=C和羰基C=O相对丰度增加以外，其余官能团均减少，在0.25～0.053 mm粒级中分别增加27.63%和18.18%，且在<0.053 mm粒级中增加程度最大，增幅分为49.83%和31.43%，其中脂肪族−CH减少16.58%～20.80%，醇酚−OH和多糖C−O的相对丰度变化不大，−CH/C=C和−CH/C=O值减小。这表明施用生物炭增加了大团聚体中有机质的脂肪族物质和微团聚体中有机质中的芳香族物质。

表1 全土和各粒级团聚体中有机质红外光谱特征峰相对丰度(%)Table 1 The relative abundance of characteristic peak in all aggregates and bulk soil

2.4 各密度组分中有机质红外光谱特征

如表2所示，两个处理的不同密度组分中有机质官能团相对丰度变化有差异，红外特征峰相对丰度最高的是多糖C−O，其次是醇酚−OH和芳香族C=C，最低的是脂肪族−CH。与−BC处理相比，+BC处理的醇酚−OH、芳香族C=C和脂肪族−CH在3个组分中相对丰度均增加，多糖C−O在LF和OF组分中降低。与−BC处理相比，在LF组分有机质中，+BC处理除了多糖C−O的相对丰度减小外，其他基团吸收峰相对丰度均增强，−CH/C=C值变化较小；OF组分有机质中，+BC处理的多糖C−O相对丰度为45.53%，减少了20.51%，而芳香族C=C和脂肪族−CH相对丰度分别增加了29.06%和125.74%，−CH/C=C值增幅达最大74.19%，同时甲基−CH3也增加了14.86%；在MF组分中，芳香族C=C、脂肪族−CH和多糖C−O相对丰度虽有增加，但增幅较小，同样羰基C=O的相对丰度变化也不大，−CH/C=C和−CH/C=O的值增大。这表明施用生物炭均增加了3个组分有机质官能团的相对丰度，其中闭蓄态轻组中有机质相对丰度增幅最大。

表2 土壤各密度组分中有机质红外光谱特征峰相对强度(%)Table 2 The relative abundance of characteristic peak in all density fractions of soil

2.5 主成分分析

2.5.1 不同粒级团聚体中有机质红外光谱特征峰主成分分析 根据特征值大于1，总贡献率大于80%的原则选取得到了2个主成分，载荷绝对值大于0.5表示与主成分相关性大，第一个主成分累计贡献率为50.8%，第二个主成分累计贡献率为35.8%。如图5A所示，+BC处理和−BC处理之间的全土、>2 mm、2～0.25 mm和<0.053 mm团聚体聚合度较小，说明施用生物炭主要引起全土、>2 mm、2～0.25 mm和<0.053 mm粒级团聚体中的有机质结构变化。由载荷图5B可知，与-BC处理相比，+BC处理中有机质官能团发生较大变化的是芳香族C=C和脂肪族−CH，说明施用生物炭主要影响全土、>2 mm、2～0.25 mm 和<0.053 mm团聚体有机质中的芳香族C=C和脂肪族−CH。

图5 全土及其各粒级团聚体有机质红外光谱特征峰主成分分析Fig. 5 Principal component analysis of infrared characteristic peak in soil organic matter in all aggregates and bulk soil

2.5.2 各密度组分中有机质红外光谱特征峰主成分分析 如图6A所示，+BC处理的LF和OF组分与−BC处理之间的聚合度较小，说明生物炭主要引起游离态轻组和闭蓄态轻组分中的有机质结构变化。由图6B可知，与−BC处理相比，+BC处理中有机质的主要变化基团是芳香族C=C、脂肪族−CH和多糖C−O，结果表明了生物炭使LF和OF组分有机质中的芳香族C=C、脂肪族−CH和多糖C−O发生变化。

图6 密度组分有机质红外光谱特征峰主成分分析Fig. 6 Principal component analysis of infrared characteristic peak in soil organic matter in density fractions

3 讨论

3.1 生物炭对土壤、各粒级团聚体和密度组分有机质含量的影响

土壤有机质作为土壤碳库主要的存在形式，对全球碳循环的平衡起着重要作用，一定程度上，土壤有机质含量决定着土壤肥力水平[27-28]。本研究中，生物炭显著提高了土壤有机质含量，2～0.25 mm和>2 mm粒径团聚体中有机质显著增加，这与李江舟等[14]在研究云南烟区红壤团聚体时，得出施加生物炭显著增加>0.25 mm粒级团聚体有机质含量的结论相一致。具有富碳和多微孔结构特性的生物炭，一方面能吸附土壤有机分子，通过表面催化活性来促进小的有机分子聚合成有机质[29]，另一方面作为有机胶结剂，能促进大团聚体的形成，而大团聚体在为有机质提供物理保护的同时，也作为新增有机质的主要载体，从而提高了土壤有机质含量。MF组分主要以有机-无机复合体的形式存在，有机腐殖化程度高，比轻组反应慢，即能稳定储存有机质[30]。本研究中，施用生物炭显著增加了LF和OF组分的有机质含量，其中OF有机质含量增幅大于LF，而生物炭对MF中有机质含量没有显著影响，这与前人[14,31]的研究结果一致，这可能与生物炭主要以稳定的芳香族碳形式存在有关，它抗微生物分解的能力强[32]，在进入土壤后提高了LF和OF组分有机质的抗分解能力。同时随着在土壤中存在时间的延长，表面钝化后的生物炭与土壤相互作用产生一种保护基质，增加了土壤有机质的氧化稳定性[33]。另外生物炭的施用可促进土壤团聚体的聚合，对OF有机质的团聚体物理保护作用增强，从而提高了OF组分的有机质储存能力，使有机质含量增加。

3.2 生物炭对土壤及其各粒级团聚体中有机质红外光谱特征的影响

在全土中，醇酚−OH、多糖C−O和脂肪族−CH的相对丰度增加，芳香族C=C和羰基C=O减少，−CH/C=C和−CH/C=O值增大，芳香族碳是难分解有机碳之一，能在土壤中选择性保留，而芳香族C=C相对丰度减少，这可能是秸秆生物炭本身的芳构化程度低，脂肪性强，对土壤中烷基碳大幅度的增加和芳香族C=C相对丰度减少产生了一定影响[9,34]。3391+3614 cm−1是−OH伸缩振动的吸收峰，主要来源于土壤中的碳水化合物，这类化合物在进入土壤后一部分吸附在矿物质表面，另一部分则进入团聚体中[35]。玉米秸秆制成的生物炭可能会含有木质素衍生物结构，是游离羟基、脂肪族类和多糖的主要来源[36]。生物炭使脂肪族−CH相对丰度在 >2 mm粒级团聚体中增加，使芳香族C=C在<0.25 mm团聚体中增加。生物炭作为胶结剂，促进了大团聚体的形成，外界进入的新鲜有机物增多，有机质周转更新加快，活性有机质官能团比例增大[37]；另外小粒级团聚体的有机质主要以腐殖质的形式存在，而生物炭极为缓慢的分解有助于腐殖质的形成[38]，减小了小粒级团聚体中有机质的降解程度。土壤大部分有机质会与土壤粘土矿物结合，不同粒级大小的土壤颗粒表面化学性质存在差异，即与土壤矿物相结合的有机质稳定性和化学性质也会存在明显的区别[39]。

3.3 生物炭对密度组分中有机质红外光谱特征的影响

施用生物炭增加了LF组分有机质中的醇酚−OH、脂肪族−CH和芳香族C=C的相对丰度，减少了多糖C−O的相对丰度，一方面生物炭孔隙结构发达，并大量集中于轻组中，能吸附聚集较多的有机物质，引起LF组分做出敏感反应，使相应的脂肪族物质和芳香族物质增加；另一方面，生物炭增加了土壤孔隙度，使外源有机物易进入这一组分，微生物活动强烈，将多糖物质分解，多糖含量减少[40]。生物炭增加了OF组分中脂肪族−CH和芳香族C=C的相对丰度，−CH/C=C值增幅最大，脂肪性结构增强，与相应组分中有机质含量测定结果相符，这主要与生物炭的重要成分是烷基和芳香结构有关，在施入土壤后增加了OF组分中的烷基−C，如脂肪酸和脂类物质[41]，其次，生物炭表面含有部分易解碳源和氮源[42]，促进了微生物活动，加速了少部分芳香碳物质的氧化分解，导致其丰度增幅没有脂肪族−CH大。施用生物炭对MF中各官能团丰度增幅影响不大，这是因为重组主要是腐殖质与土壤矿物相结合的组分，两者的化学结合能促进有机质的稳定[43]，所以其对外界响应的敏感性要低于轻组部分。同时，生物炭本身极为缓慢的分解有助于重组中腐殖质的形成[38,44]，生物炭通过长期作用使MF有机质结构更稳定更不易分解[45]。MF组分中脂肪族物质增加，使脂肪族的碳更容易吸附在矿物表面，有利于增强有机质的稳定性[46]。

4 结论

生物炭提高了土壤及其大团聚体中的轻组有机质含量，尤其对闭蓄态轻组有机质含量的提升效果最为显著。总的来看，施加生物炭致使土壤有机质结构中芳香族C=C和羰基C=O的相对丰度减少，脂肪族−CH、醇酚−OH和多糖C−O增加，−CH/C=C和−CH/C=O值升高。土壤和大团聚体中的有机质结构趋于脂肪化，微团聚体中的有机质稳定性提高。在闭蓄态轻组有机质中，与其他官能团相比，生物炭对脂肪型结构物质的相对丰度增幅最大，有利于促进该组分有机质活性的增强，加快土壤有机质的周转更新。