外源硒对冬虫夏草耳型菌核的硒含量及硒形态的影响

田宗旺 李 想 刘彦威

（河北工程大学，河北邯郸 056107）

冬虫夏草自古以来就是我国传统名贵中药，与人参、鹿茸并称为“中药三宝”，实则为中国被毛孢真菌。硒（Selenium，Se）是元素周期表第34号元素，是一种非金属元素，性质介于硫元素和碲元素之间，最初被视为对人体有害的元素。我国直到20世纪60年代对克山病的防治研究才发现硒对人体有益，是人体不可缺少的微量元素[1]。硒还是抗氧化剂谷胱甘肽过氧化物酶、代谢酶硫氧还蛋白还原酶、甲状腺激素激活酶和碘甲状腺原氨酸5−去碘酶等多种酶的重要组成部分[2−4]。目前富硒方式主要靠植物、动物、微生物或人工合成。区别于动物和植物富硒，微生物富硒具有生产周期短，产量高，受环境影响小，操作简单，硒含量和硒转化率高，成本低廉等诸多优势。

笔者通过添加外源硒（Na2SeO3）培养冬虫夏草耳型菌核，探究冬虫夏草生长过程中富硒情况以及最终的硒形态，旨在为更全面地评价冬虫夏草耳型菌核富硒水平，并为富硒食品开发和其他相关研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试主要材料

冬虫夏草菌株（邯郸市禽病预防控制中心分离鉴定）；在浅层静止培养法[5−6]的基础上，配制质量浓度为10 g/L的亚硒酸钠（Na2SeO3）溶液，分别添加0µL、600µL、900µL、1 200µL、1 500µL、1 800µL、2 100µL、2 400µL、3 000µL、4 500µL和6 000µL于培养基中，对应培养基中的Na2SeO3质量浓度为0 mg/L，4 mg/L，6 mg/L，8 mg/L，10 mg/L，12 mg/L，14 mg/L，16 mg/L，20 mg/L，30 mg/L，40 mg/L。每个质量浓度设3个重复。将培养基置蒸汽灭菌柜中121℃灭菌30 min。待完全冷却至室温后按质量分数为2%接种量接种试验菌种。18℃静止培养5个月20 d。得到的冬虫夏草耳型菌核经真空冷冻干燥，超微粉碎后作为试验样品。

1.2 供试主要试剂

消解所用化学试剂均为优级纯，购于国药集团。Tris/HCl，链霉蛋白酶E购于北京索莱宝科技有限公司。硒标准品购于sigma。除另有注明，所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。

1.3 仪器和设备

原子荧光光谱仪（配硒空心阴极灯）Kylin S18（北京吉天仪器有限公司）；天平BSA124S（德国Sartorius公司）；电热板DRB4 030 A（冠森生物科技有限公司），MARS6微波消解仪（美国CEM公司）配聚四氟乙烯消解内罐；Flexar Binary液相色谱仪（美国PerkinElmer公司）；NexIon 300DICP−MS（美国PerkinElmer公司）；高速离心机400R（美国Thermo公司）

1.4 硒含量标准溶液的制备

参照GB 5009.93-2017[7]做标准曲线，如图1所示。

图1 硒含量标准曲线

1.5 试样消解

总硒含量测定消化方法参照GB 5009.93—2017[7]，无机硒含量测定消化方法参照GB 1903.22-2016[8]微波消解步骤。

硒形态测定消化采取酶解法：称取约0.05 g的样品于聚四氟乙烯管中，加入10 mL 50 mol/L的Tris/HCl缓冲液和10 mg链霉蛋白酶E。旋涡振荡器混合均匀后，将聚四氟乙烯管放入微波消解器。萃取程序如下：先用时10 min上升至40℃，保持60 min，微波功率为160 W，然后再用时5 min上升至45℃，保持20 min，微波功率为200 W。微波萃取结束后，将样品倒入15 mL塑料离心管，以8 000 r/min离心3 min，过0.45µm滤膜，上机备用。

1.6 硒含量分析参数

仪器参数：总灯电流70 mA，辅阴极灯电流35 mA，光电倍增管负高压270 V，原子化高度8 mm，载气流量300 mL/min，屏蔽气流量800 mL/min。

进样泵参数：步骤一，时间0 s，A泵转速1 500 r/min，B泵转速0 r/min；步骤二，时间27 s，A泵转速100 r/min，B泵转速120 r/min。

测量条件：测量方式为标准曲线法，读数方式为峰面积，延迟时间1 s，读数时间15 s，加液时间8 s，进样体积2 mL。

硒含量计算公式参照文献[7]。

富硒率=有机硒含量（µg/g）×平均干燥质量（g）/外源硒添加量（µg）×100%

1.7 硒形态分析参数

HPLC条件：Hamilton PRP−X100阴离子交换柱（250 mm×4.1 mm，10µm），流动相为5 mmol/L柠檬酸溶液（pH 4.7，10%氨水调节），流速1.5 mL/min，进样量50µL。

ICP−MS条件：RF功率1 300 W，等离子气（Ar）流速15 L/min，反应气（CH4）流速0.8 mL/min，Rpq值0.6，雾化气流速1.0 L/min。采集80Se同位素数据。

2 结果与分析

2.1 冬虫夏草耳型菌核培养结果及富硒情况

培养的冬虫夏草耳型菌核干燥后质量如表1。测得硒标准曲线的方程为Y=56.547X+0.567，R2为0.999，表明线性关系良好。将各样品测得的荧光强度值代入标准曲线方程，得出总硒和无机硒含量（表2）。

表1 冬虫夏草耳型菌核干燥后质量

表2 冬虫夏草耳型菌核富硒情况

由表2可以看出，外源硒添加的质量浓度在4~16 mg/L，随着质量浓度的递增，耳型菌核中的总硒含量随之递增。添加的质量浓度为16 mg/L时，耳型菌核富硒率最大，为23.326 6%，无机硒质量分数为0.046 8 mg/kg。外源硒质量浓度越高，冬虫夏草耳型菌核中有机硒富硒率越高，但当外源硒质量浓度为20 mg/L时，富硒率下降至17.813 9%，表明外源硒添加的质量浓度大于20 mg/L会抑制冬虫夏草菌对硒的富集。国标GB 1903.22—2016规定富硒食用菌粉，总硒质量分数为18~400 mg/kg，因此，对照表2可知，外源硒添加的最佳质量浓度为10 mg/L，该质量浓度下，耳型菌核的有机硒质量分数和富硒率相对较高。由于硒添加30 mg/L和40 mg/L严重抑制其生物量，未纳入表2统计。

图2 硒标准品离子色谱图

2.2 硒形态测定分析

根据图3看出，样品中一共含有7种形态硒，1.394 4 min，1.528 8 min，1.747 2 min，2.536 8 min，3.427 2 min，4.720 8 min，5.560 8 min处出现峰值，对比硒标准品峰图可以确定样品中对应的硒形态分别为硒代胱氨酸、未知硒形态、甲基硒代半胱氨酸、四价硒、硒代蛋氨酸、未知硒形态、六价硒。其中有机硒标准品中硒代乙硫氨酸出峰时间在12 min左右，而样品在12 min没有峰，说明冬虫夏草耳型菌核中没有硒代乙硫氨酸。

图3 样品离子色谱图

利用单点校准公式作标准曲线，通过峰面积代入公式即可计算原始质量分数，再通过称样量和定容体积可以计算最终质量分数。由表3可以看出，有机硒中硒代胱氨酸，甲基硒代半胱氨酸，硒代蛋氨酸最终质量分数高，有机化程度高，四价硒和六价硒最终质量分数低，与国标方法原子荧光光谱测总硒和无机硒的结果一致。通过酶解提取到的蛋白态和无机态有损失，另外还有一些未知蛋白态以及一些硒糖类。

表3 冬虫夏草耳型菌核硒形态

样品离子色谱图与DENG等[9]谱图样品出峰顺序一致，出峰时间也大致相同，查阅相关文献[10−11]推测1.528 8 min和4.720 8 min时间出峰样品分别为硒代半胱氨酸和N−乙酰−硒代蛋氨酸。

3 小结与讨论

微生物富硒是在代谢过程中将无机硒插入到蛋白质的二硫键而引起结构弱点，实现从无机硒到有机硒的转化。JI等[12]发现硒质量浓度会影响菌丝生物量，与无添加硒培养基比较，低质量浓度的硒显著促进菌丝的生长。ZHANG等[13]设置20～80 mg/L四个梯度质量浓度深层发酵冬虫夏草，采用原子吸收光谱法测得平均富硒质量分数为900µg/g，1 040µg/g，1 709µg/g，1 552µg/g。笔者发现在0~20 mg/L外源硒质量浓度内总硒质量分数最高为631 mg/kg，当外源硒质量浓度在4~16 mg/L，冬虫夏草富硒率维持在21%以上，但当质量浓度为20 mg/L时富硒率降为17.812 9%。研究结果表明，添加硒不能促进菌丝成长，可能是因为采用的是浅层静止的培养方法和人工复配的培养基，培养基、培养方式和检测方法有别于前人研究，另外不同菌株的富硒水平也存在差异，具体原因还有待进一步研究。

BHATIA等[14]利用HPLC−ICP−MS方法检测富硒双孢蘑菇，模拟胃肠道提取硒，测得硒的形成以硒代蛋氨酸为主，占检测物种总数的73%，以及一些其他被氧化的硒物种存在；另一方面，只有2%的样品以硒（IV）形式存在于无机硒中；在胃肠消化过程中产生的其他一些低分子量硒化合物（占色谱硒含量的25%）仍未鉴定。研究中的富硒冬虫夏草耳型菌核无机硒含量较低，作为富硒食品更安全，品质也更高。

对于硒形态测量，NEHZATI等[15]利用高能荧光检测X射线吸收光谱法测定硒形态，建立硒代氨基酸光谱图，且克服了复杂混合物硒形态形成的一些缺陷，同时证明硒代氨基酸的光谱与它们的硫同属物有很强的相似性，X射线吸收光谱也存在不能区分元素价态的缺点。笔者采用HPLC−IPC−MS法分析富硒冬虫夏草耳型菌核硒形态，对比标准谱图结果准确，而两种未知硒形态还需进一步确定研究。