外周血ctDNA在结直肠癌中的临床筛查研究

马玉红，刘永瑛，赵良玉，辛国军，唐媛媛,李玉珍

结直肠癌多指大肠癌，是当代发病率较高的一种恶性肿瘤[1]。早期因症状不明显，多与肛裂、结肠炎等疾病混淆，导致错诊、漏诊，耽误患者在最佳时间接受治疗[2-3]。因此，早期诊出是提高患者生存时间的重点。以往临床多采用影像学检测，但一些细小的病灶难以被发现[4]，普通的肿瘤标志物灵敏度又较低[5]，活检为有创手段，并不适用所有患者[6]，故寻求新的检测手段是关键。外周血ctDNA是将肿瘤组织细胞释放进入血液中的DNA片段，能够反映原发肿瘤组织的情况，携带有效的分子信息，临床通过将外周血ctDNA进行基因测序，达到反映患者体内肿瘤基因突变的目的，能够将其作为诊断结直肠癌患者的有效方式[7-8]。目前将该手段应用于结直肠癌患者诊断的研究较少，且对其预后复发转移情况进行分析诊断的研究稀缺，为此，本研究分析了97例患者的临床资料，旨在为该类患者今后的诊治及监测提供有效依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料：回顾性分析2020年5月至2021年9月期间本院收治且行根治性手术的97例结直肠癌患者的临床资料，对其进行临床及随访研究。

1.1.1 纳入标准：①术前由活检及电子结肠镜检测证实且符合结直肠癌诊断标准[9]，符合手术相关指征；②符合《赫尔辛基宣言》中的伦理审查标准；③临床资料完整；④病症非转移瘤。

1.1.2 排除标准：①合并手术相关禁忌证；②合并其他恶性肿瘤；③合并原发肿瘤病灶未全部切除；④合并术前新辅助治疗；⑤合并妊娠、哺乳期孕妇；⑥合并消化道肿瘤疾病史。

1.2 方法

1.2.1 肿瘤组织免疫组化：取肿瘤组织进行石蜡切片(厚度约4 μm)，烘烤后脱蜡并采用二甲苯、梯度酒精、磷酸盐缓冲液(PBS)清洗。通过高-中-低火冷却后继续采用PBS液清洗3次。采用3%的过氧化氢抑制过氧化氢酶30 min，而后继续采取PBS液清洗3次。采用5%的BSA培育0.5 h，滴入MLH1/MSH2/MSH6/PMS2抗体，放在适宜温度下静置，而后用PBS液清洗3次。清除PBS液后加入链霉亲和素，适宜温度下静置10 min，用PBS液清洗3次，而后加入二氨基联苯胺(DAB)染色液，在镜下观察5 min。清水洗净后使用苏木素染色，用盐酸酒精分化后清水洗净，脱水后封片待检。玻片由本院的2～3名医生进行阅片，得出一致结果。

1.2.2 外周血CEA定量检测：抽取所有患者术前1 d 及术后1个月的外周肘静脉血3 mL标本，3 000 r/min离心10 min后取上层血清待测，采用罗氏E601全自动免疫分析仪及配套试剂盒进行检测。

1.2.3 肿瘤组织基因检测与外周血ctDNA基因测序：①获取外周血ctNDA。②获取白细胞DNA。③获取组织DNA。④DNA片段化：将提取的组织及白细胞DNA经过片段化收集100～250 bp片段，采用NEBNext dsDNA Fragments酶切打断，使用OMEGA Gel Extraction回收纯化。⑤文库DNA构建：采用Kapa Biosystems公司的KAPA HTP Library Preparation Kit试剂盒进行操作。⑥DNA测序：DNA 的测序捕获采用Roche 的杂交试剂盒 SeqCap EZ Library Kit 进行，捕获后的DNA文库交由深圳市海普洛斯生物有限公司协助测序。⑦测序结果分析：数据整理后提取有用的碱基信息，对信息进行质控、有效整理及删减，校正数据；整理信息，对变异信息进行解释。

2 结果

2.1 97例结直肠癌患者的一般资料：本研究97例结直肠癌患者中，男性61例、女性36例；平均年龄(62.58±10.36)岁；结肠癌患者为38例，直肠癌患者为59例；患者肿瘤分期集中在Ⅰ～Ⅱ期60例，集中在Ⅲ～Ⅳ期37例；有29例患者存在家族疾病史；有62例患者接受术后化疗。

2.2 97例结直肠癌患者肿瘤组织S-P免疫组化与基因检测结果：97例患者S-P免疫组化检测MLH1/MSH2/MSH6/PMS2蛋白结果与肿瘤组织基因测序同样的基因位点结果一致，两者检测的灵敏度、特异度及准确率均为100%，见表1。

表1 97例结直肠癌患者肿瘤组织S-P免疫组化与基因检测结果比较

2.3 97例结直肠癌患者肿瘤组织基因检测与外周血ctDNA基因测序结果：97例患者肿瘤组织TP53、APC、KRAS、PIK3CA基因位点测序提示，共发生突变87例，未突变10例；外周血基因测序结果提示突变77例，未突变20例，且突变的77例患者均在肿瘤组织测序中显示突变，肿瘤组织测序突变有2例未检出。外周血ctDNA基因测序的灵敏度、特异度及准确率分别为88.5%、100%、89.7%，见表2。

表2 97例结直肠癌患者肿瘤组织基因检测与外周血ctDNA基因测序结果比较

2.4 结肠癌与直肠癌患者术前ctDNA含量比较：97例结直肠癌患者中，结肠癌患者59例，占比60.82%，直肠癌患者38例，占比39.18%，结肠癌患者术前每2 mL外周血ctDNA含量为(17.95±8.40)ng，直肠癌患者术前每2 mL外周血ctDNA含量为(11.73±5.39)ng。两独立样本Wilcoxon秩和检验结果显示，直肠癌与结肠癌患者术前外周血ctDNA含量比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.5 术前外周血ctDNA与CEA诊断结直肠癌结果：术前外周血ctDNA诊断结直肠癌患者的灵敏度与准确率均为76.3%。术前CEA检测出19例患者的CEA水平超过阈值，灵敏度与准确率均为19.6%。术前CEA检测灵敏度与准确率均显著低于术前外周血ctDNA诊断，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 术前外周血ctDNA与CEA诊断结直肠癌结果比较

2.6 术后外周血ctDNA与CEA值检测结直肠癌患者复发及转移的情况：术后外周血ctDNA预测结直肠癌复发的灵敏度为100%、特异度为78.4%、准确率为80.4%；术后检测外周血CEA预测结直肠癌复发的灵敏度为33.3%、特异度为73.9%、准确率为76.3%，见表4。

表4 术后外周血ctDNA与CEA值检测结直肠癌患者复发及转移的情况比较

3 讨论

随着人们生活方式及社会环境的变化，结直肠癌的发生率居高不下，且发病年龄下降，呈现一定的年轻化趋势[10-11]。部分患者在疾病早期的症状并不显著，一旦确诊后多进入中晚期，严重影响生存质量，故对结直肠癌进行早期的诊断及治疗是提高患者生活水平及生命周期的关键[12]。随着医疗技术的发展，传统的病理学诊断已无法满足临床的要求，故寻求新的诊断方式是医疗行业急需解决的问题。ctDNA是一种新的“液体活检”技术，常用于检测微小的肿瘤病灶或评估肿瘤药物治疗情况[13]。而二代测序技术的发展为ctDNA的检测提供了便利[14]，在本研究中，其应用于结直肠癌的诊断中有较好的效果。

本研究结果显示，肿瘤组织基因测序的检测结果与免疫组化检测结果相同，诊断的准确率均达到100%，这表明采用基因测序进行结直肠癌诊断有很高的可行性。而后将外周血ctDNA基因测序结果与肿瘤组织基因测序结果进行比较，发现97例患者能够检查到至少一个与肿瘤组织相同的基因突变，外周血ctDNA测序的诊断敏感度为88.5%、特异度为100%、准确率为89.7%。这个结果表明其对于诊断结直肠癌的效果较为科学，能够有效应用在临床诊断中，故对于某些无法获取肿瘤组织的患者及需要进行反复活检的患者来说，能够使用抽取外周血的方式代替活检[15]。本研究显示，术前结肠癌患者外周血ctDNA含量显著高于直肠癌患者，提示结肠癌患者外周血ctDNA基因突变的数量可能高于直肠癌患者，但该结论缺乏大量的已知研究证实，故不做详细探究。除此之外，临床用于诊断结直肠癌患者术后复发情况的方式是定量检测某些血清肿瘤标志物表达量的改变，例如血清CEA、CA199水平等[16]，但该指标可能因为合并其他疾病而表达异常，故单独进行检测的价值较低。本研究将外周血ctDNA作为肿瘤标志物应用在结直肠癌患者术前术后的诊断中，并与CEA值进行比较，结果显示外周血ctDNA的诊断灵敏度及特异度均为76.3%，显著高于CEA值诊断。另外，外周血ctDNA检测结直肠癌患者术后复发及转移的灵敏度及准确率均明显高于CEA，提示能够将外周血ctDNA作为一种新的肿瘤标志物应用于早期诊断及术后监测肿瘤中。

综上所述，结直肠癌患者外周血ctDNA的检测效果理想，能够与肿瘤组织活检相结合灵活运用于临床检测中。采用外周血ctDNA评价肿瘤负荷的灵敏度及准确性高于CEA值，提示在今后能够将其作为临床诊断的依据，为患者预后做出有效评估。本研究存在样本数量有限的问题，在今后的研究中将会进一步扩大样本的数量，使研究结果更具说服力。