QuEChERS-UPLC-MS/MS 法测定猕猴桃中12 种农药残留的研究

程 泷， 黄 露，冯 吉，吴 玉，邱栋樑

（1.德阳市食品药品安全检验检测中心，四川德阳 618000；2.德阳市食品检验重点实验室，四川德阳 618000）

0 引言

猕猴桃是猕猴桃科猕猴桃属植物，其果肉质地柔软、口感酸甜，深受消费者喜爱，中国是猕猴桃的原产地，在种植过程中，也会存在一些病虫害，造成猕猴桃产量的损失，主要病害有溃疡病、炭疽病、膏药病、软腐病、灰霉病、根腐病、褐斑病及生理性缺素症等，虫害有小薪甲、叶蝉、斜纹夜蛾、红蜘蛛、介壳虫、根结线虫、蝽类等。同其他水果一样，猕猴桃在生长过程中使用化学农药是防治病虫害的重要手段和措施，杀虫剂、杀菌剂、植物生长调节剂、保鲜剂等的使用比较普遍[1-3]。近年来，我国猕猴桃种植面积扩大，各主要猕猴桃产区病虫害发生的频次有所增加，以至于农药使用增多。为了防止生产上存在滥用、超剂量使用造成农药残留超标的情况，给猕猴桃质量安全带来一定的隐患，影响消费者健康，因此有必要对目前市场流通环节中猕猴桃产品中农药残留状况进行监控。

现行国家标准检验方法为GB/T 20769—2008[4]水果和蔬菜中农药残留量分析的液相色谱-串联质谱检测。但该方法前处理操作繁琐、消耗大量，对环境有污染的试剂如乙腈、甲苯这样的有机溶剂，不适合大批样品的快速定性及定量分析。ANASTASSI-ADES 等于2003 年首次提出QuEChERS 前处理方法，与固相萃取柱净化法相比，具有前处理高效快捷、溶剂用量少、样品制备简便、回收率良好，可同时处理大批量样品等优点，在农药残留分析中得到广泛的应用[5-12]。超高效液相色谱串联质谱仪（Ultra Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometer，UPLC-MS/MS）对于基质复杂、干扰严重的痕量化合物能够在短时间进行定性定量分析。使用超高效液相色谱－串联质谱法，以猕猴桃作为研究对象，对QuEChERS 前处理净化剂的选择、色谱条件、样品复溶溶剂等做了优化研究，以构建一种能有效去除色素、糖类等杂质干扰因素，能用于猕猴桃中农药残留快速检测并节约成本的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

（1）液相色谱－串联质谱仪。Agilent 1290 型超高效液相色谱仪，美国安捷伦公司产品；QTRAP 4500 三重四极杆/复合线性离子阱质谱，配有电喷雾离子源（ESI）、MultiQuantTM 定量软件，美国AB SCIEX 公司产品；MS205DU 型电子天平，瑞士Mettler-Toledo 公司产品；MTN-5800A 型氮吹浓缩装置，天津奥特赛恩斯仪器有限公司产品；VG3 S025 型涡旋振荡器，德国IKA 公司产品；HLS-1053 型组织破碎机，深圳海力士公司产品；TGL-16A 型台式高速冷冻离心机，长沙平凡仪器仪表有限公司产品。

（2）12 种农药标准溶液。吡虫啉、啶虫脒、多菌灵、烯酰吗啉、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、辛硫磷、霜霉威、敌百虫、杀虫脒、唑虫酰胺、噻虫嗪、噻虫胺（1 000 μg/mL）、乙二胺-N-丙基硅烷（PSA，45 μm），北京振翔科技有限公司提供；乙腈、甲醇（色谱纯），德国Merck 公司提供；甲酸（优级纯），成都科隆化学品有限公司提供；氯化钠、无水硫酸镁（分析纯），成都科龙化工试剂厂提供；石墨化炭黑（GCB，45 μm），北京振翔提供；尼龙微孔滤膜，天津津腾公司实验设备有限提供。

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液配制

（1）混合标准使用液。分别精密量取不同质量浓度均为1 000 μg/mL 的标准溶液逐级稀释得混合标准使用液（质量浓度为吡虫啉400 ng/mL，啶虫脒400 ng/mL，多菌灵400 ng/mL，烯酰吗啉200 ng/mL，甲氨基阿维菌素174.8 ng/mL，辛硫磷20 000 ng/mL，霜霉威50 ng/mL，敌百虫200 ng/mL，唑虫酰胺50 ng/mL，杀虫脒1 000 ng/mL，噻虫嗪5 000 ng/mL，噻虫胺 10 000 ng/mL）。

（2）标准工作曲线。精密量取混合标准使用液0.01，0.02，0.04，0.10，0.20 mL 用空白样品提取液定容至2.00 mL 制得标准工作曲线。

1.2.2 样品处理

猕猴桃去柄取全果，打碎混匀。称取10 g 试样于50 mL 离心管中，加入10 mL 乙腈和2 g 氯化钠，涡旋振荡器上混合3 min 后置于离心机中以转速7 000 r/min 离心5 min 分层。

取5 mL 上层有机相加入到内含150 mg PSA、30 mg 石墨化炭黑（GCB）和600 mg 无水硫酸镁的50 mL 离心管中。涡旋振荡器上混合1 min 后置于离心机中以转速7 000 r/min 离心2 min，将全部上清液过0.45 μm 有机微孔滤膜到10 mL 试管中40 ℃水浴氮吹至干。用1.00 mL 的0.1%甲酸水溶液∶甲醇（1∶1）复溶后涡旋振荡器上混匀，过0.22 μm 有机微孔滤膜于进样瓶中待测定。

1.3 仪器条件

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Agilent SB C18RRHD（1.8 μm，2.1 mm×50 mm）；进样体积10 μL；流动相：A 为0.1%甲酸水溶液，B 为乙腈；流速0.5 mL/min，柱温35 ℃。

梯度洗脱条件见表1。

1.3.2 质谱条件

电喷雾离子源（ESI），正离子模式扫描，多反应监测（Multiple reaction monitoring，MRM），电喷雾电压（IS）：5 500 V，碰撞气（CAD）：Medium，离子源温度（TEM）500 ℃。

12 种农药的特征离子参考质谱条件见表2。

表2 12 种农药的特征离子参考质谱条件

1.4 数据处理

采用Excel 和Origin 8.5 进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 净化条件的优化

为了除去样品中的色素及其他杂质，降低基质干扰，减少样品在进样过程中对色谱柱和离子源的污染，对QuEChERS 法常使用的3 种净化剂：PSA、Z-Sep+、石墨化炭黑（GCB）进行筛选。PSA 由硅胶键合乙二胺基-N-丙基得到一种固相吸附剂，具有2 个氨基，有去除糖、有机酸、脂肪酸、花青素色素、金属离子等的能力。Z-Sep+是一种在硅胶基质表面双重键合了C18和Z-Sep+（二氧化锆涂层的二氧化硅）的新型填料，对甘油酯和磷脂具有很强的吸附力，可以用于净化脂肪含量大于15%的样品。石墨化炭黑（GCB）可以有效去除色素和固醇类杂质。分别称取PSA、Z-Sep+、GCB 3 种净化剂各30，100，150，300，500 mg，加入5 mL 空白样品提取液和600 mg 无水硫酸镁，再加入12 种农药标准使用液，考查这3 种净化剂各自作用效果，通过回收率考查及观察样本颜色变化考查净化剂对目标物的吸附情况及去除色素杂质的效果。150 mg PSA 农药回收率在60%～81%，300 mg 以上总体回收率开始下降，并且无明显除色素作用。对于GBC 加入100 mg的样品虽然色素能够部分去除，但是多菌灵回收率只有42%，原因可能是其六元环结构会吸附对称结构及平面结构的农药，导致回收率降低[13-14]。而加入100 mg 的Z-Sep+的样品中多菌灵、杀虫脒、敌百虫有明显吸附，回收率分别只有38%，46%，50%。可能是农药有羟基（-OH）、氨基（-NH2）等官能团，可与Z-Sep+含有的氧化锆（ZrO2）发生路易斯酸-碱作用，从而导致农药损失[15]。考虑到猕猴桃样本脂肪类含量少但有大量色素及糖类等杂质的存在，最终使用内含600 mg 无水硫酸镁、150 mg PSA 及30 mg GCB 的QuEChERS 净化剂。

2.2 色谱条件优化

为了得到较好分离度的农药色谱峰、避免杂质与检测农药共同进入离子源造成基质效应干扰影响试验，所以对流动相及比例优化。因为检测的12 种农药均为正离子模式，为了提高离子化效率以0.1%的甲酸水溶液为水相。再筛选甲醇和乙腈作为有机流动相。当用甲醇作为流动相可以使各农药色谱峰有很好的分离度，但是柱压较高，不利于色谱柱和设备的运行，如果降低流速可减小柱压但又增加了检测时间，不利于快速检测，以乙腈为流动相大部分出峰时间较快，柱压较低，0.5 mL/min 流速柱压也只有400 bar，这样减少检测时间，调整水相与乙腈比例后农药色谱峰也能得到较好分离度。

12 种农药的总离子流色谱图见图1，12 种农药化合物定量离子色谱图见图2。

图1 12 种农药的总离子流色谱图

图2 12 种农药化合物定量离子色谱图

2.3 复溶溶剂的考察

超高效液相色谱仪在使用1.8 μm 的C18色谱柱进样过程中通常都用较小的流速进行试验，这样溶剂效应的影响尤为明显。为了获得较好的色谱峰形并且减少溶剂效应，样品前处理时所使用的样品复溶溶剂多为初始流动相，而在试验中发现如果用0.1%的甲酸水溶液∶乙腈（9∶1）复溶过滤后，检测辛硫磷、甲氨基阿维菌素、唑虫酰胺极性小的农药回收率小于20%，样品溶液过滤膜后颜色很浅，可能原因是色素等杂质在被滤膜截留的同时对极性较小农药有部分吸附导致回收率低。而用0.1%的甲酸水溶液∶乙腈（1∶1）复溶过滤后检测，虽然辛硫磷、甲氨基阿维菌素、唑虫酰胺回收率大于60%，但是霜霉威、多菌灵、杀虫脒、噻虫嗪这样极性较大的农药因为溶剂效应出峰呈现“M”型的色谱峰不利于定量，且样品溶液颜色较深。最终选用0.1%的甲酸水溶液∶甲醇（1∶1）溶液复溶过滤，回收率均大于60%，溶液颜色较浅。通过试验得知选择合适复溶液过滤后既能再次除部分残留色素，又能保证峰形完整和检测的回收率。

2.4 基质效应的考察

基质效应是由待测物质被共流出的其他杂质组分，影响电喷雾电离过程中的离子化所致，表现为基质增强或抑制作用。猕猴桃中含有的色素、糖类、维生素等内源物质，均为农药残留检测过程中基质效应产生的来源[16-20]。试验通过比对同浓度基质配制的标准溶液和定容溶剂0.1%的甲酸水溶液∶甲醇（1∶1）配制的标准溶液的仪器检测峰面积比值来评价基质效应，即基质效应=空白基质标准溶液峰面积/溶剂标准溶液峰面积。基质效应大于1 为基质增强效应，反之则为基质抑制效应。

猕猴桃中12 种农药基质提取液中的基质效应见表3。

表3 猕猴桃中12 种农药基质提取液中的基质效应

由表3 可知，猕猴桃中12 种农药均呈现基质抑制效应，且霜霉威、敌百虫、辛硫磷基质抑制较为明显，所以采用猕猴桃基质稀释标准溶液作工作曲线来校正猕猴桃基质效应。

2.5 方法的线性关系、检出限、回收率和相对标准偏差

使用猕猴桃阴性样品提取液，稀释12 种农药的混合标准溶液配制成基质标准曲线，在优化好的UPLC-MS/MS 仪器条件下进行测定。各农药组分定量离子的峰面积做为纵坐标，各农药组分的质量浓度为横坐标，绘制校准工作曲线。以3 倍信噪比（S/N）确定方法的检出限（LOD）。以3 个不同质量浓度做加标回收试验，每个质量浓度点测定6 次，计算平均回收率和相对标准偏差（RSD）。猕猴桃中12 种农药质量浓度为0.25～2 000 ng/mL 时，相关系数大于0.995 9，该方法检出限为0.02～1.50 μg/kg。在不同添加量下，12 种农药平均回收率为61.5%～81.5%，相对标准偏差为3.0%～10.2%，试验结果可信。

12 种农药的线性特征、检出限见表4，猕猴桃中12 种农药组分的回收率和相对标准偏差（n=6）见表5。

表4 12 种农药的线性特征、检出限

表5 猕猴桃中12 种农药组分的回收率和相对标准偏差（n=6）

3 结论

基于QuEChERS 净化前处理对猕猴桃中12 种农药残留的超高效液相色谱-串联质谱的检测方法。相比于国标方法GB/T 20769—2008，该方法简便、快速、净化效果好，有较好回收率，更加节约时间和成本，适用于猕猴桃中农药快速筛查，对推动猕猴桃主要产区农药残留调查有积极意义，还可进一步探究其他水果蔬菜中农药快速检测的可行性。