UPLC-Q-TOF-MS测定赣南脐橙中的硒代氨基酸*

傅世利，兰费香，符娜妮，杨志燕，李 勋，薛 珺

(赣南师范大学 化学化工学院，江西 赣州 341000)

硒是一种人体必需的微量元素，在自然界的存在方式为无机硒和植物活性硒.研究发现，硒对人体作用效果、毒性等与摄入硒的化学形态密切相关，有机硒不仅比无机硒毒性小，而且具有更高的生物利用而更易被人体吸收[1].有机硒主要存在形式有硒代氨基酸、硒多肽和硒蛋白等，植物可通过自身代谢作用将无机硒有效地转化为不同形态的有机硒[2-3].然而，许多地区地壳中硒分布不均匀的地理性质导致天然食物中缺乏硒元素，因此，富硒食品成为人们补硒的重要来源.赣南脐橙是江西农产品特色品牌与地理标志产品，通过富硒种植赣南脐橙可作为人们补硒食品的一种大众选择.同时提升赣南脐橙产业竞争力，助力我国富硒功能农业的持续健康发展.

目前，食品中硒代氨基酸的检测方法有HPLC-ICP-MS、SE-HPLC、HPLC-AFS、IR-RP-HPLC、HPLC-ESI-MS/MS等联用技术[4].其中，HPLC-ICP-MS因其灵敏度高、检出限低等优点被广泛应用.然而，UPLC-MS 技术在植物中硒形态分析并不多见，同时应用UPLC-Q-TOF-MS进行硒代氨基酸的分析研究尚未报道.因此，本研究建立了脐橙中3种硒代氨基酸的UPLC-Q-TOF-MS检测方法，该方法分析速度快，准确可靠，特异性强，可用于富硒脐橙中3种硒代氨基酸的分析检测.但大分子量及大量的基质对于该方法存在较大干扰.

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

9030型LC-MS(日本Shimadzu公司)；KQ5200DE型台式数控超声波清洗器(东莞市科桥超声波设备有限公司)；ZWYR-240恒温培养振荡器(上海智诚分析仪器制造有限公司)；H1850型台式高速离心机(湖南赫西仪器装备有限公司)；RGF-7700型原子荧光光度计(北京博晖创新科技有限公司)；MAP001C38超滤离心管(1000 Da，美国颇尔公司)；FreeZone-2.5L真空冷冻干燥机(美国LABCONCO公司).

甲基-硒代半胱氨酸(MeSeCys)溶液标准物质(以Se计：(34.8±1.0) μg/g，GBW10088，中国计量科学研究院)；硒代蛋氨酸(SeMet)溶液标准物质(以Se计：(39.4 ± 1.0)μg/g，GBW10034，中国计量科学研究院)；硒代胱氨酸(SeCys2)溶液标准物质(以Se计：(44.2±1.0)μg/g，GBW10087，中国计量科学研究院);乙腈(质谱纯，美国霍尼韦尔公司)；甲醇(质谱纯，美国霍尼韦尔公司)；胰蛋白酶(源自牛胰腺，上海生物生工工程公司).所用水为屈臣氏饮用水(广州屈臣氏食品饮料有限公司).普通脐橙购自赣州市本地市场，富硒脐橙采自赣南师范大学脐橙学院实验基地.

1.2 实验方法

1.2.1 硒代氨基酸工作液的配制

准确称取各适量硒代氨基酸标准溶液，用屈臣氏饮用水配成1 μg/mL的单标标准储备液，置于4 ℃冰箱储存备用.取1.0 mL各单标标准储备液，于10 mL容量瓶中，用屈臣氏饮用水定容，配成浓度为100 ng/mL的混合标准使用溶液.

1.2.2 样品制备

将脐橙用纯净水洗净，吸水纸将外表水吸干，剥去果皮，取果肉，冷冻干燥后粉碎，储于干净的封口袋中备用，同时检测其冻干去除水分含量.普通脐橙冻干去除水分含量为87.4%，富硒脐橙冻干去除水分含量为87.9%.按照食品安全国家标准《食品中硒的测定》(GB5009.93-2017)湿法消解，氢化物原子荧光光谱法测定，普通脐橙样品总硒未检出，富硒脐橙样品总硒为30.56 μg/kg.

1.2.3 提取方法

超声水提取法：精确称取约0.1 g(±0.000 1 g)制备好的试样至10 mL离心管中，并加入5 mL屈臣氏饮用水，涡旋混匀后，在常温条件下超声60 min，离心(10 000 rpm，30 min)，取上清液，残渣部分湿法消解.

蛋白酶酶解法：精确称取约0.1 g(±0.000 1 g)制备好的试样至10 mL离心管中，加入5 mL屈臣氏水，涡旋混匀后，超声30 min.随后，加入5 mg胰蛋白酶，恒温振荡(37 ℃，100 rpm)12 h.酶解结束后，离心(10 000 rpm，30 min)，取上清液，残渣部分湿法消解.

上述提取液上机前用超滤离心管(1 000 Da)去除大分子，再用0.22 μm微孔滤膜过滤；残渣按食品安全国家标准食品中硒的测定之氢化物原子荧光光谱法(GB5009.93—2017)检测硒含量.

1.3 仪器分析条件

1.3.1 色谱条件

色谱柱：AccQ·TagTM氨基酸色谱柱(3.9 mm×150 mm)；流动相：水-甲醇(体积比90∶10)；柱温：35 ℃；进样量：10.0 μL；流速：0.4 mL/min.

1.3.2 质谱条件

ESI离子源，正离子模式，MRM模式，扫描范围为质荷比(m/z)100-500;离子源温度300 ℃；雾化气(氮气)3 L/min；干燥气(氮气)10 L/min；碰撞气(氩气)230 kPa；去溶剂温度250 ℃；加热块温度400 ℃；接口温度150 ℃，接口电压3.00 kV.3种硒代氨基酸的质谱分析参数见表1.

表1 3种硒代氨基酸的质谱分析参数

3 结果与讨论

3.1 色谱柱的选用

参考相关文献，以水-甲醇为流动相，选用C18柱和AccQ·TagTM氨基酸色谱柱对3种硒代氨基酸的分离情况进行了对比测试.试验结果显示，3种硒代氨基酸在C18柱上保留时间很短，分离效果差，而使用AccQ·TagTM氨基酸柱在适当的流动相条件下，3种硒代氨基酸在7 min内达到完全分离并且峰型较好.本试验选用AccQ·TagTM氨基酸色谱柱作为实验的色谱柱.

3.2 流动相的优化

在已优化质谱条件下，用浓度为100 ng/mL的硒代氨基酸标准混合溶液对色谱条件进行优化，考虑高分辨Q-TOF质谱对溶剂的要求，本实验分别选用了水-乙腈、水-甲醇作为流动相进行优化实验.

选用水-乙腈体系为流动相，改变水与乙腈的比例，3种硒代氨基酸均不能得到很好的分离；选用水-甲醇体系为流动相，当甲醇比例较高时，SeCys2和MeSeCys难以分离，当甲醇比例降至10%时，3种硒代氨基酸达到完全分离，且峰型较好.在优化色谱条件下，MeSeCys、SeCys2和SeMet3种硒代氨基酸提取色谱图见图1.

图1 3种硒代氨基酸提取色谱图(A：SeCys2；B：MeSeCys；C：SeMet)

3.3 质谱条件优化

分别在正离子和负离子模式下对3种硒代氨基酸标准液进行SCAN扫描，扫描范围为质荷比(m/z)100-500，在正离子模式下3种硒代氨基酸母离子响应信号强度远高于在负离子模式时信号强度，所以选择ESI正离子模式进行分析.

在ESI正离子模式下分别对浓度为100 ng/mL的3种硒代氨基酸进行扫描，优化去溶剂温度、离子源温度，获得各化合物稳定的母离子峰.然后在SIM模式下优化接口电压得到最佳值为3.00 kV.再于MRM模式下，优化CE值，得到SeCys2、MeSeCys和SeMet的最佳CE值分别为15.0 V、10.0 V和25.0 V.硒元素有6种同位素，其中Se80丰度最高，本实验得到分子离子峰主要是[M80+H]+.3种硒代氨基酸MRM质量色谱图见图2.

图2 3种硒代氨基酸的MRM质量色谱图(A：SeCys2；B：MeSeCys；C：SeMet)

3.4 提取方法的选择

目前从试样中提取有机硒形态的前处理方法主要有：水提法、酸提法、碱提法、酶解法[5-6].在酸性和碱性条件下，容易使其它硒化合物降解，破坏原有的硒形态，较高的温度也会导致SeMet形态的转变，因此，本实验选择条件比较温和的水提取和酶提取法进行试验.取富硒脐橙样品0.1 g，分别采用超声水提法、蛋白酶酶解法对样品进行提取，通过总硒和残渣部分硒含量的差值计算出不同提取方法的提取率(以湿基计)，结果见表2.

表2 不同提取方法的提取效率

结果表明，超声水提法与蛋白酶酶解法提取率相近.硒代氨基酸在植物中存在形式主要为游离态或与多肽、蛋白结合的结合态，水提取法提取的是游离的无机硒和小分子的可溶态硒化合物，蛋白酶能酶解与多肽和蛋白质结合的有机硒，但脐橙的主要成分为纤维素、果胶、糖和柠檬酸等，蛋白含量非常少，所以水提法和蛋白酶酶解法提取率相似.对于脐橙中硒代氨基酸的检测，蛋白酶酶解法提取过程耗时，水提取法提取速度快且提取液基质相对更少，可以尽可能降低后期检测基质的干扰.本实验选择超声水提取法提取脐橙中硒代氨基酸.

3.5 方法的线性范围、检出限、定量限

取SeCys2、MeSeCys和SeMet混合标准溶液，逐级稀释配制成系列标准溶液并按优化条件分析，选择SeCys2(336.920 0>247.872 3)、MeSeCys(183.987 1>166.960 6)、SeMet(198.002 8>108.955 1)作为定量离子对，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，根据对应离子对相应强度，绘制标准曲线.以信噪比S/N=3计算方法检出限(LOD)和S/N=10计算方法定量限(LOQ).SeCys2、MeSeCys和SeMet的线性范围、线性方程、相关系数、方法检出限和定量限见表3.3种硒代氨基酸在5 ng/mL～100 ng/mL线性范围内均呈现良好的线性关系，相关系数R2≥0.997，SeCys2、MeSeCys、SeMet的检出限分别为6 ng/mL、10 ng/mL、1 ng/mL，定量限分别为18 ng/mL、35 ng/mL、3 ng/mL.

表3 3种硒代氨基酸的线性关系、检出限与定量限

3.6 加标回收实验

取普通脐橙试样,按1.2.3超声水提取法提取,提取液超滤后作为基质，进行加标回收实验.根据3种硒代蛋氨酸检出限水平不同，为了准确测定，分别设置不同的加标水平，每个添加水平进行6次平行实验，计算3种硒代氨基酸的回收率和精密度，结果见表4.结果表明，3种硒代氨基酸的加标回收率在78.8%～92.2%之间，相对标准偏差在2.1%～7.5%之间，说明方法可以满足脐橙样品中的SeCys2、MeSeCys和SeMet的定性、定量检测，但基质对3种硒代氨基酸分析均有干扰，干扰程度依次为MeSeCys>SeCys2>SeMet.

表4 脐橙皮中3种硒代氨基酸形态的加标回收率和精密度(n=6)

4 结论

本文建立了UPLC-Q-TOF-MS测定脐橙中硒代氨基酸的分析方法.通过比较超声水提法、蛋白酶酶解法提取率，发现对于蛋白含量极少的脐橙，其硒代氨基酸主要以游离态存在.实验选择更加快捷的超声水提法进行样品提取，经过超滤离心管去除大分子干扰后再分析，通过方法学验证，方法可用于脐橙中SeCys2、MeSeCys和SeMet的检测，但基质对3种硒代氨基酸分析均有一定干扰.在仪器最优条件下对赣南富硒脐橙中3种硒代氨基酸进行检测，试验结果表明所采集的赣南富硒脐橙中3种硒代氨基酸含量均低于方法检出限.