光固化涂料中光引发剂迁移行为及其细胞毒性的研究

俞自航,朱 叶,刘敬成,刘 仁

(光响应功能分子材料国际联合研究中心,江南大学化学与材料工程学院,江苏无锡 214122）

紫外光（UV）固化技术因其具有高效、节能、经济、环保、适用性广的“5E”优点被广泛应用于油墨、涂料、胶粘剂等行业[1-2]。光固化体系主要由低聚物、活性稀释剂、光引发剂以及其他助剂组成；其中光引发剂虽然占比少，但却是光固化体系中的重要组分。光引发剂在辐照下从基态跃迁至激发态，激发态的电子会导致自身化学键的断裂或和其他组分发生相互作用形成活性种，使体系中的低聚物和活性稀释剂发生聚合[3]。目前商品化的光引发剂大多为小分子，利用率较低，其在紫外光的辐照下并不会完全转化为活性种来引发聚合反应，固化后所得的产品中会残留大量未反应的光引发剂。这些小分子化合物在一定条件下会从固化产品中迁移到环境中[4]，对环境造成污染，甚至威胁生命体的健康[5-6]。

随着科技的进步和人们生活水平的提高，光引发剂迁移问题受到越来越多的关注，各国政府也出台了相应的法律法规：欧盟制定了《关于化学品注册、评估、许可和限制的法规》（REACH）对市场上商品化的光引发剂进行预防性管理；美国颁布了《有毒物质控制法》（TSCA）来管控光引发剂的生产和使用；瑞士颁布了关于印刷油墨的RS 817.023.21 规定[7]，给出了诸如2-羟基-4'-（2-羟乙氧基）-2-甲基苯丙酮（2959）和2-苄基-2-（二甲基氨基）-1-[4-（4-吗啉基）苯基]-1-丁酮（369）等裂解型光引发剂的特定迁移限值。国内也有学者针对光引发剂的迁移进行了研究：黄秀玲等[8]探究了1-羟基环己基苯基甲酮（184）、2，2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮（651）由聚乙烯淋膜纸向食品模拟物迁移的影响因素，总结了光引发剂在不同温度、不同溶剂中的迁移动力学规律；韩伟等[9]以65%乙醇和正己烷作为食品模拟物，探究了光引发剂在食品模拟物中的迁移行为，建立了食品包装油墨中光引发剂迁移的实验和检测方法。刘珊珊等[10]总结了食品接触材料中光引发剂的检测方法，列举了这些检测方法的检出限以及回收率。但国内对光引发剂迁移的研究多集中在食品包装领域，很少涉及到光固化涂料。

紫外-可见（UV-Vis）分光光度计法、气相色谱法（GC）和高效液相色谱法（HPLC）是检测痕量光引发剂的主要方法。UV-Vis 分光光度计法[11]适用于组分单一的光引发剂的定性定量分析，一旦体系中含有2种或2种以上吸收光谱重叠的物质，就无法使用该仪器对待测光引发剂进行定量分析。GC[12]可以分离易挥发且热稳定好的物质，适用于大多数光引发剂的检测，但对于相对分子质量较大、沸点较高的光引发剂如（2，4，6-三甲基苯甲酰基）二苯基氧化膦（TPO）和苯基双（2，4，6-三甲基苯甲酰基）氧化膦（819）等，却无法进行分离。HPLC[13]是一种利用样品中不同组分与色谱柱吸附能力的差异实现分离检测的方法，其在分析速度、效能以及检测的灵敏度方面，都可以和GC 相媲美，目前已在生物制药、食品以及环境监测等领域获得了广泛的应用。HPLC 一般与质谱（MS）或二极管阵列检测器（DAD）联用，其中HPLCDAD 联用仪可以对液相色谱分离出的物质的紫外-可见吸收光谱进行检测，具有分离效果好、针对性强等优点，对小分子光引发剂的分离与检测具有普适性。

本文以环氧丙烯酸酯类光固化涂料为主要研究对象，通过HPLC-DAD 联用仪建立了光固化涂料中光引发剂迁移量的检测方法；通过该方法探究了温度、涂料配方中活性稀释剂的种类、含量以及固化工艺中辐照量和膜厚对光引发剂迁移行为的影响；并且通过MTT 法（细胞存活率分析法）和细胞荧光染色法对涂膜的细胞毒性进行了系统的评价。

1 实验部分

1.1 主要原料和仪器

环氧丙烯酸酯（RY1101）：工业级，江苏开磷瑞阳化工股份有限公司；2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮（1173，纯度98%，下同）、1-羟基环己基苯基甲酮（184，98%）、2-甲基-1-[4-（甲基硫代）苯基]-2-（4-吗啉基）-1-丙酮（907，98%）、（2，4，6-三甲基苯甲酰基）二苯基氧化膦（TPO，98%）、乙腈（色谱纯）：上海阿达玛斯试剂有限公司；丙烯酸羟乙酯（HEA，97%）、二缩三丙二醇二丙烯酸酯（TPGDA，90%）、季戊四醇三丙烯酸酯（PETA，96%）、季戊四醇四丙烯酸酯（PET4A，95%）、二甲基亚砜（DMSO，99%生物技术级）、四甲基偶氮唑盐（MTT，99%生物技术级）、钙黄绿素AM（96%）、碘化丙啶（95%）：上海麦克林生化科技有限公司；RPMI-1640 培养基（生物技术级）、青霉素-链霉素双抗溶液（生物技术级）、缓冲液（PBS，生物技术级）：美国Hyclone Laboratories 责任有限公司；胰蛋白酶-EDTA 溶液（生物技术级）：西格玛奥德里奇（香港）控股有限公司；小鼠胚胎成纤维细胞（L929）：苏州赛尔飞生物科技有限公司。

Ultimate 3000 RS高效液相色谱仪：安捷伦；Q800型动态热机械分析仪：美国TA 仪器公司；BYK 框式涂膜器：德国毕克化学公司；F300 型履带式光固化机：美国 Fusion 公司；INFINITE 200 PRO 型多功能酶标仪：瑞士帝肯；Nikon 80i 正置荧光显微镜：日本尼康株式会社。

1.2 光引发剂标准曲线的测定

用乙腈分别配置质量浓度为1 g/L 的光引发剂1173、184、907以及TPO的标准储备溶液，使用时稀释成 一 系列 质量浓 度为 5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、500 mg/L 的 待 测 溶 液 。 通 过HPLC-DAD 对4 种光引发剂的标准曲线进行测定。使用的色谱柱为SHIMSEN Ankylo C18 柱，柱温为20 ℃，进样量 20 μL；流动相A 为超纯水，流动相 B 为乙腈，检测1173 的流动相梯度见表1；检测184、907和 TPO 的流动相梯度为：0~20 min，φ（流动相A）=φ（流动相B）=50%；总流速均为2 mL/min；测试时间为20 min；二极管阵列检测器的吸收波长区间为190~400 nm，定量分析波长为245 nm；以光引发剂浓度为横坐标，出峰面积为纵坐标，拟合得到表2 中4种光引发剂的标准曲线。

表1 流动相梯度Table 1 Mobile phase gradients

表2 4种光引发剂的线性方程与线性相关系数Table 2 Linear equations and linear correlation coefficients of four photoinitiators

1.3 UV固化涂料及涂膜的制备

光固化涂料具体配方如表3 所示。将光引发剂、活性稀释剂以及光固化树脂RY1101，在避光条件下充分搅拌均匀，真空脱泡后得到光固化涂料。文中所用光引发剂及活性稀释剂结构如图1所示。

表3 UV固化涂料配方Table 3 Formulation of UV-curable coatings

图1 光引发剂和活性稀释剂的结构式Fig.1 The structural formulas of photoinitiators and reactive diluents

用丙酮擦拭玻璃板表面，以除去基材表面的污染物。利用BYK 框式涂膜器在玻璃基材表面制备一层厚度为120 μm 的湿膜，随后使用履带式光固化机以5.7 m/min 的速度对湿膜进行6 次曝光固化，单次辐照能量约为150 mJ/cm2，辐照总能量为900 mJ/cm2。固化完成后，将涂膜从基材上剥离，进行后续实验。

1.4 性能测试

1.4.1 涂膜中光引发剂迁移率测试

将固化后的涂膜用粉碎设备裁剪成一定尺寸，称量约20 mg 涂膜，精确至0.1 mg，放置于离心管中；按照每0.1 g 涂膜加入10 mL 乙腈在一定温度条件下进行恒温浸提，提取时间为12 h；提取完毕后用0.22 μm 的有机相滤膜过滤提取液，再用乙腈将滤液稀释10 倍。随后使用HPLC-DAD 对浸提液进行测试，根据光引发剂在液相色谱柱中的保留时间以及二极管阵列检测器测到的紫外-可见吸收光谱对光引发剂进行定性定量测试，液相色谱与二极管阵列检测器的分析条件与1.2所述一致。

本实验使用迁移率作为研究光引发剂迁移行为的评价对象，计算如式（1）所示。

式中：m1—光固化涂料中光引发剂质量，根据光引发剂在配方中的添加量得到的；m2—光引发剂的迁移质量，将溶剂浸泡涂膜后得到浸提液，利用HPLCDAD法来进行定量分析得到的。

1.4.2 涂膜交联密度测定

涂膜的交联密度采用动态热机械分析仪进行测试，测试条件为从30 ℃开始以5 ℃/min的速率升温到180 ℃，根据式（2）计算出涂膜的交联密度[14]。

式中：E'—橡胶态平台区的储能模量，通常取比Tg高40 ℃处的储能模量，Pa；R—理想气体常数，8.314 J（/mol·K）；T—热力学温度，K。

1.4.3 涂膜表面细胞毒性测定

将涂料涂覆在厚度为0.05 mm 的304 食品级不锈钢基材上，固化后剪成1 cm×1 cm 的正方形薄片，放入24孔培养板中，每孔中加入1 mL的L929细胞悬液（每mL 含2×105个L929 细胞），另设空白304 不锈钢基材作为阴性对照；将24 孔板置于37 ℃培养箱（CO2体积分数5%，相对湿度95%）内培养，24 h 后每孔加入钙黄绿素AM 溶液（1 mol/L 的DMSO 溶液）至其最终浓度为20 mmol/L，随后马上加入碘化丙啶（1 mol/L 的PBS 溶液）溶液至其最终浓度为40 mmol/L，继续培养10 min。取出样品用无菌PBS溶液冲洗2 次，用正置荧光显微镜分别在493 nm 及535 nm的激发波长下观察L929细胞在涂膜表面的生长形态及存活情况，每个样品至少选取6个不同位置拍摄数码照片。拍摄后将样品转移至每孔含1 mL 新鲜培养基的24 孔培养板中，再每孔加入100 μL 质量浓度为5 g/L 的MTT 溶液，培养4 h 后吸除混合培养基，每孔再加入1 mL 的DMSO 并振荡溶解3 min；用酶标仪测定DMSO 溶液在570 nm 处的吸光度（OD值），以630 nm 作为参考波长，通过式（3）计算得到细胞相对活力。实验中每个样品至少3个独立培养孔，实验数据用平均值±标准偏差表示。

2 结果与讨论

2.1 温度对光引发剂迁移率的影响

不同的环境条件对光引发剂的迁移会有一定的影响，实验以1173 为光引发剂，TPGDA 为活性稀释剂，RY1101为低聚物制备了光固化涂膜，探究温度对光引发剂1173迁移行为的影响，结果如图2所示。

图2 光引发剂1173迁移率随迁移温度的变化Fig.2 Migration ratio of 1173 varied with migration temperature

由图2 可知，光引发剂的迁移率随着时间的增加表现出先增加后不变的趋势，当迁移时间达到6 h时，光引发剂的迁移率已趋于稳定，因此后续的迁移实验时间调整为12 h。此外，温度对光引发剂迁移率的影响较为明显，在前1 h 内，温度越高，光引发剂的迁移率越高，但迁移时间达到6 h 后，虽然高温加速分子的热运动，但是对光引发剂迁移率几乎没有影响，从侧面表明延长迁移时间不会进一步增加光引发剂的迁移率，考虑到光固化涂料的实际应用环境，最终选择的迁移温度为20 ℃。

2.2 活性稀释剂对光引发剂迁移率和细胞毒性的影响

活性稀释剂是光固化涂料的重要组成部分，它不仅可以用来代替溶剂调节光固化涂料配方的黏度，还可以用来改善涂膜的各种性能。本实验以1173作为光引发剂，研究了活性稀释剂的种类（官能度）对光引发剂迁移率和细胞毒性的影响，结果如图3所示。

从图3 可以看出随着活性稀释剂官能度的增加，光引发剂的迁移率从单官活性稀释剂HEA 涂膜的48.60% 降到了双官活性稀释剂TPGDA 涂膜的38.98%，这一方面是因为单官能度活性稀释剂的反应活性较高，引发聚合所需要的活性种更少，导致更多的光引发剂残留在涂膜中，另一方面是因为随着活性稀释剂官能度的增加，涂膜的交联密度从2 121.05 mol/m3增加到4 457.52 mol/m3，形成了更加致密的交联网络结构使光引发剂更难迁移出来，导致光引发剂的迁移率出现下降。而随着活性稀释剂官能度的进一步增加，迁移率几乎不变，这是因为多官活性稀释剂的反应活性基本相同并且聚合物交联网络无法阻碍溶剂进入涂膜中提取光引发剂，因此光引发剂迁移率保持不变。由于不同活性稀释剂对光引发剂迁移率的影响不大，因此涂膜的细胞毒性没有表现出一个较为明显的规律，且培养基对光引发剂的提取率较低，导致涂膜表现出较低的L929细胞毒性，最终选用TPGDA作为后续实验的活性稀释剂。

图3 活性稀释剂种类对光引发剂迁移率和细胞毒性的影响Fig.3 Effects of type of reactive diluents on migration ratio of photoinitiators and cytotoxicity

图4 为TPGDA 含量对光引发剂迁移率和细胞毒性的影响。

图4 活性稀释剂含量对光引发剂迁移率和细胞毒性的影响Fig.4 Effects of content of reactive diluents on migration ratio of photoinitiators and cytotoxicity

由图4 可以发现活性稀释剂含量对光引发剂迁移率的影响较小，其最大值为43.34%，最小值为38.56%。这是因为低聚物RY1101 与TPGDA 的丙烯酸酯官能团的反应活性相似，改变低聚物与活性稀释剂的比例对聚合反应所消耗的活性种数目影响较小。此外还发现活性稀释剂含量对涂膜的交联密度的影响显著低于活性稀释剂种类的影响。由图4（b）可知活性稀释剂含量的变化对L929细胞的毒性几乎无影响，这一方面是因为光引发剂的迁移率变化很小，另一方面是因为活性稀释剂绝大部分参与到聚合反应中，仅有极少量的活性稀释剂会发生迁移[15]。

2.3 光引发剂种类对迁移率和细胞毒性的影响

目前，市场上有很多商品化UV光引发剂，为了探究不同光引发剂对迁移率及细胞毒性的影响，除1173外本实验还选用184、907和TPO作为研究对象，实验结果如图5所示，其中4种光引发剂均占配方总质量的3%，图6为不同浓度的纯光引发剂对L929的细胞毒性。

图5 光引发剂种类对光引发剂迁移率和细胞毒性的影响Fig.5 Effects of type of photoinitiators on migration ratio of photoinitiators and cytotoxicity

由图5 可知，使用不同光引发剂对涂膜迁移率的影响很大，一方面是由光引发剂的相对分子质量大小决定的，相对分子质量越大的光引发剂，其迁移率越低[16]；另一方面UV 光源发射波长与光引发剂吸收波长的匹配性[17]、光引发剂的量子产率[18]和生成初级自由基的活性差异[19]的共同作用导致TPO 在涂膜中的残留量较少，故TPO 的迁移率会更低。结合图6分析可知，在TPO 浓度较高的情况下，其表现出较为明显的细胞毒性。但是将TPO 引入到光固化涂料中，发现其几乎没有细胞毒性，这是因为涂膜中的TPO迁移率很低。除TPO 外，其余3种光引发剂及其参与固化的涂膜均没有表现出明显的细胞毒性。因此，选择光固化涂料配方不仅要考虑光引发剂本身的毒性，最好还要结合实际应用对涂料的毒性进行测试，两者的结果可能并不一致。

图6 不同光引发剂及其浓度对细胞毒性的影响Fig.6 Effects of different photoinitiators and concentrations on cytotoxicity

2.4 光引发剂含量对迁移率和细胞毒性的影响

为了提高光固化涂料中的活性种浓度以抑制氧阻聚作用并提高UV 固化效率[20]，实际应用中会增加光引发剂的用量。图7为光引发剂1173的含量从1%逐步增加至9%的过程中，迁移率和细胞毒性的变化情况，其中光引发剂含量以配方总质量计。

图7 光引发剂含量对光引发剂迁移率和细胞毒性的影响Fig.7 Effects of content of photoinitiators on migration ratio of photoinitiators and cytotoxicity

由图7 可知，随着光引发剂含量的增加，其迁移率由36.25%逐渐增加至50.15%。这是因为在辐照量固定的前提下，被UV 所激发生成活性种并引发聚合反应的光引发剂是有限的[21]，因此随着光引发剂含量的增加，涂膜中残留光引发剂的比例会随之增加，导致光引发剂迁移率增加。随着光引发剂含量的增加，涂膜的细胞毒性逐渐显现出来，当光引发剂含量达到5%及以上时，细胞活性＜80%，表现出对L929 细胞有一定的毒性作用。总体来看，细胞毒性与光引发剂迁移率是正相关的。

图8 为不同光引发剂含量对细胞形态变化的荧光染色照片。

图8 不同光引发剂含量对细胞形态变化的荧光染色照片Fig.8 Fluorescence staining photos of cell morphological changes with different photoinitiator contents

由图8 可知，1%光引发剂含量的涂膜上存活的细胞（被染为绿色）生长非常密集，且多数细胞呈纺锤形，死亡的细胞（被染为红色）较少。当光引发剂含量超过5%时，细胞生长的密度较低，且死亡细胞的比例更高，这表明高光引发剂含量的涂膜对细胞生长有一定的抑制作用。因此在实际应用中1173 添加量最好选择低于5%的配方作为光固化涂料。

2.5 辐照量对光引发剂迁移率和细胞毒性的影响

UV 是诱导光引发剂分解生成自由基的能量来源，光的辐照剂量直接决定了光引发剂的分解程度，而光辐照时间与光辐照剂量成正比关系，可以通过调控光辐照的时间来控制光辐照的剂量。实验选取1173 作为光引发剂，研究了辐照量对光引发剂迁移率的影响，结果如图9所示。

图9 辐照量对光引发剂迁移率和细胞毒性的影响Fig.9 Effects of UV irradiation on migration ratio of photoinitia⁃tors and cytotoxicity

由图9 可知，随着辐照量的增加，光引发剂的迁移率从63.99%降低至38.98%且其降低速率逐渐变小，最终保持不变。这是因为在聚合反应初期随着光辐照次数的增加，更多的光引发剂会被激发诱导聚合反应，导致光引发剂的迁移率出现了明显的下降，而随着辐照量的进一步增加，由于该反应体系已经达到很高的转化率，笼蔽效应导致光引发剂产生的活性种无法参与聚合反应[22]，用以引发聚合的光引发剂会显著减少，导致最终光引发剂的迁移率趋于稳定。当辐照次数较少时，涂膜中光引发剂的迁移率较高且体系的固化程度还没达到完全，由于丙烯酸酯基团对细胞有一定的刺激作用[23]，因此表现出一定的细胞毒性，随着辐照量的进一步增加，涂膜完全固化，其生物相容性变好。

图10 为不同辐照量对细胞形态变化的荧光染色照片。

由图10 可以发现，较低辐照量的涂膜对细胞抑制生长的作用十分显著，涂膜上的细胞密度较低且死细胞数较多。当辐照次数＞3 次后，涂膜抑制细胞生长的作用较小，辐照4次时，细胞的生长情况最好。这可能是因为辐照量的进一步增加会导致光引发剂光解产物量的小幅度增加，从而抑制了细胞的生长。

图10 不同辐照次数对细胞形态变化的荧光染色照片Fig.10 Fluorescence staining photos of cell morphological changes with different UV irradiation

2.6 膜厚对光引发剂迁移率和细胞毒性的影响

图11 为湿膜厚度对光引发剂1173 迁移率和涂膜细胞毒性的影响。

由图11 可知，120 μm 涂膜的光引发剂迁移率比60 μm 的涂膜高9.8%，因为表层的光引发剂能够吸收部分紫外光，导致深层的光引发剂吸收的紫外光强度下降，而这一作用随着膜厚的增加而增强，因此膜厚的增加会提升涂膜中光引发剂的迁移率。增加膜厚虽然会在一定程度上提升光引发剂的迁移率，但却不会抑制细胞的生长，3 种膜厚的涂膜均没有表现出明显的细胞毒性。因此，膜厚不是影响毒性的主要因素。

图11 膜厚对光引发剂迁移率和细胞毒性的影响Fig.11 Effects of film thickness on migration ratio of photoinitia⁃tors and cytotoxicity

3 结 语

本研究建立了UV 固化涂料中光引发剂迁移率的检测和涂膜细胞毒性的评价方法，使用HPLCDAD 得到了不同涂料配方和固化工艺所制得涂膜的光引发剂迁移率，此外还用MTT 和细胞荧光染色法评价了不同涂膜的细胞毒性，结合光引发剂迁移率等因素对细胞毒性结果进行分析。研究发现高光引发剂含量及低UV 辐照量对光引发剂迁移率的影响较大，从而导致涂膜存在细胞毒性；不同的光引发剂对迁移率影响较大，而对细胞毒性的影响不大；活性稀释剂的种类和添加量对迁移率的影响有限，且均没有表现出较为明显的细胞毒性。