柱前衍生化反相高效液相色谱法测定春雷霉素

张佳庆，杨闻翰，张 丹，侯德粉

（沈阳沈化院测试技术有限公司，沈阳 110021）

春雷霉素（Kasugamycin）是一种低毒、内吸性杀菌剂，通过内吸治疗作用来发挥其药效。春雷霉素的前身是一种由小金色放线菌产生的抗菌素[1]，最早由中国科学院微生物研究所于1964年在江西土良地区发现。自春雷霉素上市以来，在全世界范围内被广泛应用于农业生产上[2]。它对稻瘟病、桃树流胶病、穿孔病、西瓜细菌性角斑病等病害的防治具有显著作用[3]。

春雷霉素属于碱性物质，其结构特点为极性大，易溶于水，故在液相色谱行为上表现为色谱的保留时间短[4-5]，对于结构相近的生产杂质，很难达到理想的分离效果，从而给检测的准确度造成了影响。目前，对于春雷霉素含量测定的液相色谱分析方法，一般选择较为复杂的流动相配制体系，通常采用一定浓度的十二烷基磺酸钠水溶液作为基本的流动相，再配合一定比例的有机相。然而，大浓度的缓冲盐体系对色谱柱损耗严重，影响色谱柱的寿命，提高了检测成本。本研究开发了柱前衍生方法，对春雷霉素的结构进行了衍生化，通过增加衍生基团，使春雷霉素具有良好的紫外吸收特性。通过调整春雷霉素的极性，可实现在乙腈-水为流动相体系下，对春雷霉素的原药含量进行分析。此法检测灵敏度高，重现性好，经济实用，并且可以同时实现对春雷霉素原药中一般杂质的有效分离，为春雷霉素产品的分析提供了一种创新性的思路。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Acquity-Micromass Quattro premier液质联用仪，美国沃特世公司；Dionex U3000高效液相色谱仪，美国赛默飞世尔公司；Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），安捷伦科技（中国）有限公司；XS205DU电子天平，梅特勒托利多科技（中国）有限公司；四硼酸钠、甲醇、乙腈，以上均为色谱纯，美国SIGMA ALDRICH公司；醋酸（分析纯），国药集团化学试剂有限公司；标准品春雷霉素（纯度98.0%），国家农药质检中心（沈阳）；春雷霉素原药，河北安米诺氨基酸科技股份有限公司；氯甲酸-9-芴甲酯（FMOC-Cl），北京百灵威科技有限公司。

1.2 仪器条件

色谱条件。柱温：30℃；流速：1.0 mL/min；进样量：5 μL；检测器波长：265 nm。采用梯度洗脱，洗脱程序见表1。

表1 流动相梯度比例

质谱条件。离子源模式：ESI＋；电离电压：3.5 kV；锥孔电压40 V；气帘气流速：50 L/h；裂解气流速：600 L/h；裂解气温度：400℃；离子源温度：120℃；分子量采集范围设置：100～600（m/z）。

1.3 溶液配制

1.3.1 标准溶液的配制

称取春雷霉素标准品0.05 g（精确至0.000 1 g）置于烧杯中，用水溶解，稀释并定容于50 mL容量瓶中作为标样母液。取1.0 mL母液置于烧杯中，再加入1 mL 125 mmol/L四硼酸钠溶液来调节酸碱度，之后加入1.5 mL 4 g/L FMOC-Cl乙腈溶液作为衍生化试剂。将溶液放置在30℃水浴中反应20 min，待衍生完全后，将溶液冷却至室温，再用甲醇-水（1∶2，V/V）稀释并定容于10 mL容量瓶中，用0.45 μm滤膜过滤，备用。

1.3.2 试样溶液的配制

称取春雷霉素样品0.05 g（精确至0.000 1 g）置于烧杯中，用水溶解，稀释并定容于50 mL容量瓶中作为样品母液。其余操作步骤与标准溶液的配制相同。

1.4 测定

待仪器状态稳定后，对标样溶液和试样溶液进行测定，取样品和标样2针的平均峰面积进行公式的计算。

1.5 数据分析

根据标样溶液和试样溶液的峰面积，按式（1）计算样品中春雷霉素的质量分数w。

式中：A1、A2分别为标样溶液和试样溶液中春雷霉素衍生物峰面积的平均值，mAU·min；m1、m2分别为标样和试样质量，g；P为标样中春雷霉素的质量分数，%。

2 结果与分析

2.1 检测波长的选择

对春雷霉素标样及其衍生物进行紫外光谱扫描（图1）。春雷霉素未衍生化之前的最大紫外吸收峰在207 nm附近，且无其他波长的特征吸收峰，所以在对未衍生化的春雷霉素进行色谱分析时，只能选择较低的紫外波长，此段波长的干扰较大，而经过衍生化的春雷霉素在265 nm附近出现了特征的紫外吸收峰。在该波长处，样品的灵敏度较高，无低波数的溶剂干扰，能够满足液相色谱紫外检测器的分析要求，因此选择的检测波长为265 nm。

图1 春雷霉素及其衍生物的紫外吸收对比图

2.2 春雷霉素衍生物的色谱分析结果

经过衍生反应（图2），向春雷霉素引入衍生化试剂氯甲酸-9-芴甲酯（FMOC-Cl）中的荧光团，从而实现高效液相色谱分离及测定。同时，过量的FMOC-Cl会完全水解成衍生副产物FMOC-OH，其与春雷霉素衍生物的结构相似，因此具有相同的荧光激发和检测波长。在以上色谱条件下，春雷霉素衍生物的保留时间为6.8 min；其水解衍生副产物FMOC-OH的保留时间为12.1 min（图3）。

图2 春雷霉素柱前衍生化反应示意图

图3 春雷霉素衍生后的液相色谱图

2.3 春雷霉素衍生物的质谱分析结果

将春雷霉素标样溶液在质谱条件下进行试验，通过质谱的断裂机理确定衍生化试剂（FMOC-Cl）对春雷霉素的衍生位置，以及春雷霉素衍生物的结构。春雷霉素衍生物的质谱图，见图4。

图4 春雷霉素衍生物质谱图

2.4 线性范围

按照系列稀释方法配制6个质量浓度的春雷霉素标准品溶液，在1.2所述色谱条件下进行测定。以质量浓度和峰面积为横、纵坐标绘制标准曲线，来验证方法的线性关系。线性方程为y=4 887.3x-29.319，相关系数（R2）为0.999 5（图4），R2＞0.999，则春雷霉素衍生物的色谱峰面积与其质量浓度在0.039 6～0.415 4 mg/L范围内线性关系良好，

图5 春雷霉素衍生物标准曲线

2.5 精密度与回收率的测定

按试样溶液的制备方法配制6个春雷霉素溶液。根据以上操作条件测定这6个样品溶液中春雷霉素的含量，结果见表2。在此春雷霉素样品中选取6个标样的添加水平，按本方法测定其中的春雷霉素含量，并计算添加回收率，结果见表3。从表2中可以看出，所配制的6个春雷霉素样品中相对标准偏差（RSD）为0.4%；从表3中可以看出，计算得到的回收率为98.56%～99.31%。

表2 春雷霉素精密度试验结果

表3 春雷霉素回收率试验结果

2.6 春雷霉素衍生物结构的确证

根据春雷霉素衍生物的质谱图（图4），m/z 602、422、351和378为主要的质谱峰，通过质谱的一般断裂机理来确证春雷霉素衍生物的具体结构（图6），以此验证春雷霉素衍生物的分子量和各官能团信息。

图6 春雷霉素衍生物质谱断裂机理示意图

3 结论

本文创新性地建立了柱前衍生方法对春雷霉素进行液相色谱分析，使用乙腈-水的流动相体系，解决了在传统的春雷霉素分析方法中需要使用缓冲盐溶液作为流动相而导致的体系平衡缓慢、灵敏度低、对色谱柱损耗大以及杂质分离不理想等问题，提高了对春雷霉素产品分析的简便性及可靠性。此外，本文也通过液质联用方法对春雷霉素衍生物进行了结构分析，阐明了春雷霉素柱前衍生化反应原理，并通过春雷霉素衍生化前后紫外全波长扫描图的对比，进一步证明了方法的科学性。本方法具有较高的精密度与准确度，可快速分离及测定春雷霉素有效成分的含量，线性相关性好，可为春雷霉素产品的分析提供新的思路，适用于各企业及相关检测机构对春雷霉素产品质量的监督与把控。