基于UPLC/ESI-Q TRAP-MS/MS 技术分析酸枣仁中黄酮类化合物

杨龙飞，田伟，郑倩※，姜涛※

（1.石家庄市中医院，河北 石家庄 050051；2.河北省农林科学院经济作物研究所，河北 石家庄 050051）

酸枣[Ziziphus jujuba Mill.var.spinosa (Bunge)Huex H.F.Chou]是鼠李科属灌木或小乔木植物，适应性强、喜温耐干旱，主要分布于我国北方的低山丘陵地区，如山西、陕西、河北、河南、辽宁和山东等省[1]。酸枣的根、叶、果肉和种子中含有大量的生物活性物质，其中酸枣的种子俗称“酸枣仁”，是我国大宗的中药材。据《神农本草经》《本草纲目》等记载酸枣仁具有镇静、催眠、安神、滋补、敛汗和保肝等功效，广泛用于治疗神经衰弱、失眠和焦虑。研究显示，酸枣仁中的主要生物活性成分之一是黄酮类化合物，具有镇静、催眠和宁心等功效[2]。至今已从酸枣仁中分离鉴定出27 个黄酮类化合物，其中大部分黄酮类成分为黄酮碳苷类化合物[3]。酸枣仁药理学及药代动力学的研究也主要集中在黄酮类化合物，研究认为斯皮诺素类化合物是黄酮类化合物中的主要活性成分[4]。在2010 年版《中国药典》中斯皮诺素被作为酸枣仁中黄酮类化合物的检测指标[5]。Li等[6]通过大鼠实验研究认为斯皮诺素和6-阿魏酰斯皮诺素具有镇静催眠作用。Wang 等[7]研究显示斯皮诺素能够延长由戊巴比妥所诱导的睡眠时间，提高睡眠质量。

酸枣仁中含有化合物种类繁多、结构复杂，已有研究报道利用高效液相色谱（high performance liquid chromatography, HPLC）、高效液相色谱 蒸发光散射检测法（HPLC-ELSD）、高效液相色谱 质谱（HPLCMS/MS）对酸枣叶[8]、酸枣果[9]和酸枣仁[10]中的酸枣皂苷、斯皮诺素和熊果酸等代谢物成分进行了检测，但由于这些方法检测周期长、检测化合物单一等特性，不能全面、准确地反应酸枣代谢物的成分[11]。目前超高液相色谱法（ultra performance liquid chromatography,UPLC）已成为药用植物代谢物成分快速检测、分离及鉴定的强有力手段[12]，与传统的HPLC 技术相比UPLC 具有更高的分离度、样品通量和灵敏度，极大提高了代谢物的检测效率[13]。UPLC 技术已经应用到太子参[14]、刺果番荔枝[15]、雷公藤[16]和连翘[17]等药用植物代谢物的化合物分析。综上所述，本研究基于超高效液相色谱 电喷雾离子源 三重四极杆串联质谱法（UPLC/ESIQ TRAP-MS/MS）对酸枣仁中的黄酮类化合物进行分离鉴定分析，有助于酸枣仁中黄酮类化合物的研究，对酸枣仁中的药效成分和质量控制具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

2021 年8 月20 日在河北省石家庄市赞皇县采集新鲜酸枣果，经河北省农林科学院药用植物研究中心鉴定为鼠李科枣属植物酸枣果实。酸枣果去肉、破壳获取酸枣仁，用于酸枣仁黄酮类化合物的检测。

1.2 仪器与试剂

超高效液相色谱（UPLC,Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A），串联质谱（Tandem mass spectrometry,MS/MS）（AppliedBiosystems4500QTRAP），冻干机（Scientz-100F），研磨仪（MM 400, Retsch），万分之一分析天平（BSA224S-CW），冷冻高速离心机（Eppendorf 5810R）。甲醇（色谱纯，Merck 公司）、乙腈（色谱纯，Merck 公司）和乙醇（色谱纯，Merck 公司），标准品二甲基亚砜（色谱纯，Sigma 公司）。

1.3 材料的制备

酸枣仁放置于冻干机（Scientz-100F）中真空冷冻干燥；利用研磨仪（MM400，Retsch）研磨（30Hz，1.5min）至粉末状；称取100 mg 的粉末，加70% 甲醇1.2 mL提取；溶解后的样品4 ℃冰箱过夜，其间涡旋6 次，提高提取率；离心（转速10 000 r min-1，10 min）后，吸取上清，用微孔滤膜（0.22m）过滤样品，并保存于进样瓶中，用于UPLC-MS/MS 分析。

1.4 色谱条件

色谱柱：WatersACQUITYUPLCHSST3C18，1.8m，2.1 mm 100 mm；流动相：A 相为0.04%乙酸水溶液，B 相为乙腈（含0.04%乙酸）；洗脱梯度：0 min B 相比例为5%，10.00 min 内B 相比例线性增加到95%，并维持1 min，11.00~11.10 min，B 相比例降为5%，并以5%平衡至14 min；流速0.35 mL min-1；柱温40℃；进样量4L。

1.5 质谱条件

电喷雾离子源（electrospray ionization, ESI）温度550 ℃，质谱电压5500V，帘气（curtaingas,CUR）30psi，碰撞诱导电离（collision-activated dissociation, CAD）参数设置为高。在三重四级杆（QQQ）中，每个离子对是根据优化的去簇电压（declustering potential,DP）和碰撞能（collision energy,CE）进行扫描检测[18]。

1.6 代谢物定性定量鉴定

基于MWDB 数据库（metware database），根据二级谱信息进行物质定性，分析时去除同位素信号，含K+、Na+、NH4+和CH3COO-的重复信号，以及本身是其他更大分子量物质的碎片离子的重复信号。代谢物定量是利用三重四级杆质谱的多反应监测模式（multiple reaction monitoring, MRM）分析完成。MRM 模式中，四级杆首先筛选目标物质的前体离子（母离子），排除掉其他分子量物质对应的离子以初步排除干扰；前体离子经碰撞室诱导电离后断裂形成很多碎片离子，碎片离子再通过三重四级杆过滤选择出所需要的一个特征碎片离子，排除非目标离子干扰，使定量更为精确，重复性更好。获得不同样本的代谢物质谱分析数据后，对所有物质质谱峰进行峰面积积分，并对其中同一代谢物在不同样本中的质谱出峰进行积分校正[19]。

2 结果与分析

2.1 酸枣仁UPLC/ESI-Q TRAP-MS/MS 分析

采用UPLC/ESI-Q TRAP-MS/MS 技术对酸枣仁黄酮类化合物进行鉴定，优化色谱和质谱条件对酸枣仁样品进行分析，图1 所示为酸枣仁UPLC/ESI-Q TRAP-MS/MS 的正、负总离子流（Total ions current,TIC），在正、负离子检测模式下都有明显的检测信号，利用软件Analyst1.6.3 对总离子流进行处理，并对主要峰进行标记。如图1 所示酸枣仁正、负总离子流均获得良好的分离效果和离子化效率，因此，可以结合正、负总离子流对酸枣仁黄酮化合物进行鉴定分析。

图1 酸枣仁UPLC/ESI-Q TRAP-MS/MS 的正（A）、负（B）总离子流色谱图Fig.1 Positive(A)and negative(B)total ion flow chromatograms of Ziziphi spinosae Semen in UPLC/ESI-Q TRAP-MS/MS

2.2 酸枣仁黄酮类化合物鉴定

基于MWDB 代谢数据库，对酸枣仁的黄酮类代谢物进行了质谱定性定量分析。图2 为MRM 模式下采集的代谢物多峰检测图，展示了酸枣仁中能检测到的黄酮类化合物，其中每个不同颜色的质谱峰代表检测到的一个化合物。通过三重四级杆质谱法、对照图谱和相关文献，对筛选出的化合物进行分子量和分子式分析，最终鉴定出83 个酸枣仁黄酮类化合物。对83 个酸枣仁黄酮类化合物进行结构分类分析，如表1 所示83 个黄酮类化合物共分为9 类，包括3 个查尔酮、5个二氢黄酮、2 个二氢黄酮醇、5 个花青素、18 个黄酮、22 个黄酮碳糖苷、14 个黄酮醇、9 个黄烷醇和5 个异黄酮化合物。

表1 酸枣仁中所鉴定的黄酮类化合物Table 1 Flavonoids identified in Ziziphi spinosae Semen

图2 MRM 代谢物检测多峰图Fig.2 Multi-peak map of MRM metabolite detection

续表

2.3 酸枣黄酮类化合物分析

本研究对获得的83 个酸枣仁黄酮类化合物进行统计分析，结果显示黄酮碳糖苷类化合物是酸枣仁中黄酮类化合物结构分类中数量最多的，其相对含量最高，其次是黄酮类和黄酮醇类化合物，而二氢黄酮醇类化合物数量最少，仅获得2 个化合物，分别为短叶松素和香橙素。斯皮诺素属于黄酮碳糖苷类化合物，是酸枣仁中的主要药效成分，本研究共检测到7 种斯皮诺素类化合物（见表1），其中6'''-阿魏酰斯皮诺素是酸枣仁中黄酮类化合物含量最高的物质。

2.4 黄酮类化合物结构解析

本研究共获得9 类黄酮类化合物，每一类选取一个化合物进行结构解析。

2.4.1 查尔酮类化合物根皮素的结构解析 根皮素母离子峰[M-H]-为m/z=273.07，在能量碰撞下，由分子离子峰m/z=273.07 裂解产生的碎片离子为m/z=167.03，151.00，125.02，123.04 和119.04。

图3 根皮素的裂解途径Fig.3 Fragmentation mechanism of phloretin

2.4.2 二氢黄酮类化合物柚皮素结构解析 柚皮素为二氢黄酮，母离子峰[M-H]-为m/z=271.06，在能量碰撞下，由分子离子峰m/z=271.06 裂解产生的碎片离子为m/z=151.00，还产生了m/z=119.05 的碎片离子。

图4 柚皮素的裂解途径Fig.4 Fragmentation mechanism of naringin

2.4.3 二氢黄酮醇类化合物香橙素结构解析 香橙素为二氢黄酮醇，母离子峰[M+H]+为m/z=289.06，在能量碰撞下，由分子离子峰m/z=289.06 的3 号位脱去一分子H2O 得到m/z = 271.06 [M+H-H2O]+，由分子离子峰m/z = 271.06 [M+H-H2O]+再脱去一分子CO得到m/z=243.06[M+H-H2O-CO]+。

图5 香橙素裂解途径Fig.5 Fragmentation mechanism of dihydrokaempferol

2.4.4 花青素类化合物矢车菊素-3-O-葡萄糖苷结构解析 矢车菊素-3-O-葡萄糖苷为花青素，在正离子模式下m/z=449.19 脱去糖苷，获得苷元m/z=287.06。

图6 矢车菊素-3-O-葡萄糖苷裂解途径Fig.6 Fragmentation mechanism of cyanidin 3-O-glucoside

2.4.5 黄酮类化合物结构解析 木犀草苷为黄酮，母离子峰[M+H]+为m/z=449.10，在能量碰撞下，由分子离子峰m/z=449.10脱去葡萄糖苷获得苷元m/z=287.05。

图7 木犀草苷裂解途径Fig.7 Fragmentation mechanism of cynaroside

2.4.6 黄酮醇类化合物芦丁结构解析 芦丁为黄酮醇，母离子峰[M+H]+为m/z = 611.15，在能量碰撞下，由分子离子峰m/z=611.15脱糖获得苷元m/z=303.04。

图8 芦丁裂解途径Fig.8 Fragmentation mechanism of rutin

2.4.7 黄酮碳糖苷类化合物斯皮诺素的结构解析 斯皮诺素为黄酮碳糖苷，母离子峰[M+H]+为m/z=609.18，在能量碰撞下，由分子离子峰m/z=609.18 脱一分子糖获得m/z=447.12，后脱羟基获得m/z=429.11，由m/z =429.11 获得m/z=351.08、327.08。由分子离子峰m/z=609.18 脱两分子糖获得m/z=285.07。

图9 斯皮诺素裂解途径Fig.9 Fragmentation mechanism of spinosin

2.4.8 黄烷醇类化合物儿茶素结构解析 儿茶素为黄烷醇，母离子峰[M-H]-为m/z=289.08，在能量碰撞下，由分子离子峰m/z=289.08 脱一分子水后再脱C2H2 获得m/z=245.09；B 环1'，6'键断裂后生成m/z=205.05，1'，4'键断裂后生成m/z = 203.07；C 环1，3 键断裂生成m/z =151.04 和m/z=137.03；C 环1，4 键断裂生成m/z=125.03；连接B 环和C 环的键断裂生成m/z=179.04和m/z=109.03，m/z=179.04 脱水形成m/z=161.07。

图10 儿茶素裂解途径Fig.10 Fragmentation mechanism of catechin

2.4.9 异黄酮类化合物黄豆黄苷结构解析 黄豆黄苷为异黄酮苷，母离子峰[M+H]+为m/z=447.12，脱去糖苷获得苷元m/z=285.07。

图11 黄豆黄苷裂解途径Fig.11 Fragmentation mechanism of glycitin

3 讨论

酸枣是中国卫健委颁布的第一批既是食品又是中药材的药用植物之一，具有较高的经济价值和药用价值。根据2020 年《中国药典》规定酸枣的主要药用部位为酸枣仁，来源于酸枣干燥成熟种子，功能主治补肝、宁心、敛汗和生津，用于虚烦不眠，惊悸多梦，体虚多汗，津伤口渴[20]。《中华本草》记载酸枣仁含有皂苷、有机酸、生物碱、黄酮、三萜、甾醇、多种氨基酸及微量元素等活性成分[21]。酸枣仁药效成分研究表明酸枣黄酮和酸枣皂苷是酸枣仁中的主要活性成分，具有镇静催眠作用[22]。Liu等[23]研究发现，酸枣黄酮类化合物斯皮诺素参与了GABA 和5-HT 通路，提高了大鼠的睡眠总时间。Cao 等[24]研究表明酸枣皂苷作用于5-HT通路，能够明显增强戊巴比妥的催眠作用，增加小鼠的睡眠总量。Wang 等[25]研究显示酸枣仁斯皮诺素可能是突触后5-HT1A 受体的拮抗剂，提高戊巴比妥治疗大鼠的总睡眠、非快速动眼期睡眠（NREM）和快速动眼期睡眠（REM）时间。

最近几年随着代谢组学的发展，UPLC/ESI-Q TRAP-MS/MS技术因具有灵敏度和通量高、分离速度快、覆盖范围广等优点，在植物代谢物鉴定和分析方面应用较多[26]，该技术已广泛应用于番茄[27]、草莓[28]和芦笋[29]等植物的代谢物分析。国内外围绕酸枣仁也开展了广泛的代谢学研究，李强等[30]利用代谢组学对酸枣仁水提物鉴定和推断出25 个化合物，包括12 个黄酮化合物、8 个三萜皂苷、2 个脂肪酸类和3 个生物碱。毛怡宁等[31]利用UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS 技术从酸枣仁甲醇提取物中鉴定出28 个化合物，包括21 个黄酮类化合物、5 个皂苷类化合物和2 个三萜类化合物。刘佳星等[32]基于UPLC-Q-TOF-MS/MS 技术从酸枣仁汤颗粒中鉴定出41 个来源于酸枣仁的化合物，包括28 个黄酮类化合物、7 个生物碱类化合物和6 个三萜类化合物。本研究首次采用UPLC/ESI-Q TRAP-MS/MS技术对酸枣仁甲醇提取物中的黄酮类化合物进行了快速、准确地定性定量分析，共鉴定出83 个黄酮类化合物，主要为黄酮碳糖苷类化合物，其中包括7 个斯皮诺素类衍生物。本研究利用UPLC/ESI-Q TRAPMS/MS技术能够全面分离、鉴定分析酸枣仁中的黄酮类化合物，可极大丰富酸枣仁天然化合物成分数据库，为酸枣仁药效成分研究提供参考依据。