酸浸高压法对灵芝子实体有效成分灵芝多糖的影响*

丁鸿燕，吕思敏，刘翠娟，吴 铁,，戚 怡

(1 广东润和生物科技有限公司，广东 广州 510800；2 广东医科大学，广东 东莞 523808)

灵芝是多孔菌科真菌灵芝的子实体，具有补气安神、止咳平喘、延年益寿的功效，常用于眩晕不眠、心悸气短、神经衰弱、虚劳咳喘。灵芝子实体是一伞形的菇状物，呈紫红色或棕红色，其质地幼时为肉质，成熟变干后为木栓质。子实体由菌盖(菌伞)和菌柄构成。2005年出版《中国药典》，收载赤芝和紫芝为灵芝入药品种[1]。灵芝属的化学成分较为复杂，其中有效成份可分为十大类，包括灵芝多糖、灵芝多肽、三萜类、16种氨基酸(其中含有七种人体必需氨基酸)、蛋白质、甾类、甘露醇、香豆精苷、生物碱、有机酸(主含延胡索酸)，以及微量元素Ge、P、Fe、Ca、Mn、Zn等[2-3]。现代研究证明灵芝多糖是灵芝的主要有效成分之一，具有抗肿瘤[4-5]、免疫调节[6-7]、降血糖[8]、抗氧化[9]、降血脂与抗衰老作用。低、中剂量的灵芝多糖对小鼠肝肾功能无明显影响[10-11]；可逆转2型糖尿病所引起的肠道微生物菌群和代谢紊乱[12]。灵芝多糖的种类很多，约有200多种，从灵芝的子实体、孢子粉、发酵液中都能够提取出灵芝多糖，针对提取部位和多糖种类的不同有着不同的提取方式。灵芝多糖的提取方式有：传统提取法、复合酶法提取[13]、快速溶剂萃取法[14]、超临界流体辅助提取、超滤法、微波辅助提取[15]、超声波提取、超声波-微波协同萃取。与传统工艺相比，此方式提取时间较短，提取效率也有所增加同时能够节约一定的水资源。综上，不同的提取方式都有其优缺点，要根据提取原料、条件、提取目的等综合因素考虑。因此，对于灵芝多糖的提取不局限于一种方式而是多种方式协同作用最终得到目标产物。

灵芝子实体具有致密的细胞壁结构，高压、热水、稀酸等可提高水对细胞穿透能力及细胞破坏力，可加快多糖的释放[16]，本实验研究灵芝子实体高压后加热回流提取灵芝多糖的提取工艺，先把灵芝子实体用粉碎机粉碎，然后将粉碎后的灵芝子实体用盐酸浸泡，然后采用高压破壁处理，利用高压对细胞的破碎作用，促进灵芝多糖从胞内溶出。按照药典法测定灵芝子实体中灵芝多糖的含量方法，结果如下。

1 实 验

1.1 材料与仪器

样品T1-5为实验室用莞香木栽培的灵芝子实体(莞香灵芝，专利申请号：201610320833.5)。FR223CN电子天平；粉碎机；高压灭菌锅；紫外-可见分光光度计；水浴锅；旋转蒸发仪；无水乙醇、硫酸、无水葡萄糖对照品、盐酸、蒽酮。

1.2 实验方法

1.2.1 对照品溶液的母液制备

取无水葡萄糖对照品适量，精密称定，加水制成每1 mL含0.12 mg的溶液，即得标准品母液。

1.2.2 标准曲线制备

精密量取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL，分别置10 mL具塞试管中，各加至2.0 mL，迅速精密加入硫酸蔥酮溶液(精密称取蔥酮0.1 g，加硫酸100 mL使溶解，摇匀)6 mL，立即摇匀，放置15 min后，立即置冰浴中冷却15 min，取出，以相应的试剂为空白同步显色操作，照紫外-可见分光光度法，在625 nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.2.3 供试品溶液的制备前准备

取经粉碎机粉碎的灵芝子实体赤灵芝、紫灵芝，各分为两个实验组，每组10 g，1号为赤灵芝子实体对照组，2号为赤灵芝子实体加盐酸浸泡高压实验组，3号为紫灵芝子实体对照组，4号为紫灵芝子实体加盐酸浸泡高压实验组，其中：1和3号不加盐酸浸泡不经高压，2和4号用40 mL的1%盐酸浸泡2 h，后放进高压锅高压，25 min升温121 ℃时，保持121 ℃，维持30 min，降温，2.5 h降至65 ℃时，取出，放入65 ℃烘箱烘干6.5 h(中途称重)，得供试品。

1.2.4 供试品溶液的制备

取上述编号1和2的粉末约1 g，精密称定，装袋，置圆底烧瓶中，加水30 mL静置1 h，(95±2) ℃加热回流4 h，滤过，用少量热水洗涤滤器和滤渣，将滤渣及滤纸置烧瓶中，加水30 mL，加热回流3 h，滤过，合并滤液，85 ℃旋蒸至干，残渣用水2.5 mL溶解，边搅拌边缓慢滴加乙醇38 mL，摇匀，在4 ℃放置12 h，3000 r/min离心10min，弃去上清液，沉淀物用热水溶解并转移到相应体积容量瓶中，放冷，加水至刻度，摇匀，取溶液适量，3000 r/min离心10 min，精密量取上清液适量，加水稀释，摇匀，取稀释液2 mL，即得供试品溶液。

1.2.5 灵芝多糖测定

精密量取供试品溶液2 mL，置10 mL EP管中，照标准曲线制备项下的方法，迅速精密加入硫酸蔥酮(0.1 g+100 mL硫酸)溶液6 mL，立即摇匀，放置15 min后，立即置冰浴中冷却15 min，取出，以相应的试剂为空白同步显色操作，照紫外-可见分光光度法，在625 nm波长处测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中无水葡萄糖的含量，计算，即得

2 结果与讨论

2.1 标准曲线制备

葡萄糖标准曲线紫外检测结果见表1。根据表1，葡萄糖标准曲线紫外检测结果求出标准曲线方程：y=7.8016x-0.039，R2=0.9975，线性范围：0.064～0.721。

表1 葡萄糖标准曲线紫外检测结果

2.2 供试品前准备称重

高压后的样品烘干的重量变化情况见表2。

表2 高压后灵芝子实体的干燥重量变化

2.3 供试品溶液灵芝多糖的测定

灵芝多糖紫外检测结果见表3和图1。从表3及图1灵芝多糖紫外检测结果可见，本实验中，赤灵芝子实体加盐酸浸泡后高压，提取检测的灵芝多糖明显高于未加盐酸浸泡后高压的芝子实体，其中，加盐酸浸泡后高压灵芝子实体(ω=3.669%)中灵芝多糖的含量是未加盐酸浸泡后高压芝子实体的9.9倍(ω=0.370%)。紫灵芝子实体加盐酸浸泡后高压，提取检测的灵芝多糖明显高于未加盐酸浸泡后高压的芝子实体，其中，加盐酸浸泡后高压灵芝子实体(ω=1.676%)中灵芝多糖的含量是未加盐酸浸泡后高压芝子实体的4.2倍(ω=0.400%)。

表3 灵芝多糖紫外检测结果

续表3

图1 灵芝多糖检测结果

3 结 论

本实验把灵芝子实体用粉碎机粉碎，然后将粉碎后的灵芝子实体用1～5倍的0.5%～3%的盐酸浸泡1～3 h，然后，放进高压锅高压，121 ℃维持30 min，然后，高压降温后取出样品置于65 ℃烘箱烘干5～8 h，之后，采用加热回流的方法提取灵芝子实体中灵芝多糖。赤灵芝对提取得到的灵芝多糖的含量是没有经过高压处理的9.9倍，紫灵芝对提取得到的灵芝多糖的含量是没有经过高压处理的4.2倍。综上所述：加盐酸浸泡后高压灵芝子实体中主要成份灵芝多糖的含量更高。