丹芪糖脂清颗粒剂提取工艺优化*

安紫微，彭沙丽，李筱玲，刘笑洋，刘国玉，王澳玥，姚欢欢

(商洛学院生物医药与食品工程学院，陕西 商洛 726000)

随着在社会生活方式的改变, 代谢综合征(MS)的发病率逐年上升, 而且越来越走向年轻化。据我国相关调查表明，我国本病的发病率已经达到25.9%[1]。代谢综合征病率呈逐年上升趋势，且随年龄升高而增加，是诱发心脑血管事件、致死、致残的高危因素[2]。中医学普遍认为代谢综合征的产生及发展机制与肝脾有关，认为其根本原因为脾虚，从而导致水谷不能运化所致[3]。因此我们团队在查阅相关资料，以《祝氏验方集锦》中的调节血脂代谢、降低血糖、调节血压的方剂为基础，经过加减组方，拟制成丹芪糖脂清颗粒剂。本方由黄芪、丹参、茯苓、山药、山楂、决明子、葛根、柴胡、黄芩、玉米须组成，功能健脾除湿，行气活血化瘀；主治代谢综合征，高血脂症、糖尿病、脂肪肝等症。复方中主要化学成分有水溶性物质也有脂溶性物质，传统的汤剂水煎煮法难以将其脂溶性有效成分提出[4]。本实验通过醇水双提法对丹芪糖脂清颗粒原料药进行提取。以丹参酮ⅡA及丹酚酸B的含量、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、葛根素、黄芩苷含量为指标，以乙醇浓度、料液比、提取时间为考察因素，采用正交试验法优选醇提工艺；以总黄酮含量、总皂苷含量、总多糖含量及干膏率为指标，以浸泡时间、加水量、提取时间为考察因素，采用正交试验法优选水提工艺，为丹芪糖脂清颗粒剂中有效成分的提取提供实验依据。

1 实 验

1.1 主要材料

实验所用的中药饮片均购买于鹤城大药房；无水乙醇、葡萄糖，天津市百世化工有限公司；对照品黄芪甲苷、芦丁、丹参酮IIA、丹酚酸B、黄芩苷、葛根素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷，均购于北京世纪奥科生物技术有限公司。

1.2 主要仪器

YLJYE-100数显恒温水浴锅，邦西仪器科技有限公司；EYEL4OSB-2100旋转蒸发仪，邦西仪器科技有限公司；LC-10AT高效液相色谱仪，日本岛津(中国)有限公司；SI-2002型电子天平，北京丹佛仪器有限公司；DHG-9123A型电热恒温鼓风干燥箱，上海齐欣科学仪器有限公司； UV-1780紫外分光光度计， 日本岛津(中国)有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 工艺流程

为了方便实验操作，按 “丹芪糖脂清颗粒”处方缩小10倍取丹参、黄芪、葛根、黄芩、茯苓、山药、山楂、决明子、柴胡、玉米须粗粉。先采用乙醇加热回流法对丹参、黄芩、黄芪、葛根进行回流提取，滤液备用；残渣与其余药合并，再采用水加热回流法对混合粉末共提，将醇提及水提取液，分别减压浓缩备用。

1.3.2 乙醇回流提取法条件优化

精密称取同一批饮片粗粉丹参3 g，黄芪3 g，葛根2 g，黄芩1.5 g各9份，浸泡15 min后，90 ℃水浴加热回流提取，重复提取2次，合并滤液，减压浓缩定容至50 mL容量瓶，备用。采用L9(34)正交试验设计表进行实验，根据单因素实验结果选择不同乙醇浓度、料液比、提取时间为参试因子，采用高效液相色谱法测定醇提液中丹参酮ⅡA及丹酚酸B、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、葛根素、黄芩苷含量并计算得率，优选项最佳醇提工艺。因素水平表见表1。

表1 醇提影响因素水平表

1.3.3 水回流提取法条件优化

根据单因素实验结果，选择影响较大的三个因素浸泡时间(A)、加水量(B)、提取时间(C)为考察因素，采用L9(34)正交试验设计表安排实验。具体做法为：按处方量精密称取药品粗粉茯苓3 g，山药3 g，山楂2 g，决明子2 g，柴胡1.5 g，玉米须1.5 g各9份，100 ℃水浴加热回流提取，重复提取2次，合并滤液，减压浓缩定容至50 mL容量瓶，备用。采用紫外分光光度法测定水提液中总黄酮含量、总皂苷含量、总多糖含量，并测定干膏率，优选最佳水提工艺。因素水平表见表2。

表2 水提影响因素水平表

1.3.4 验证试验

分析正交试验的结果，得到丹芪糖脂清颗粒颗粒剂提取的最佳工艺条件，按照最佳提取工艺做两组平行实验验证试验结果的准确性。

1.4 有效成分含量测定

1.4.1 醇提部位有效成分含量测定[5-8]

(1)供试品溶液的制备

取回流提取所得醇提滤液，分别使用0.45 μm微孔滤膜过滤置进样瓶中，即得。

(2)对照品溶液的制备

丹参酮ⅡA：精密称取丹参酮ⅡA对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加甲醇制成浓度为37 μg/mL的溶液，即得。

丹酚酸B：精密称取丹酚酸B对照品适量，精密称定，加甲醇-水(8:2)混合溶液制成浓度为176 μg/mL的溶液，即得。

毛蕊异黄酮葡萄糖苷：精密称取取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成浓度为263 μg/mL的溶液，即得。

葛根素：精密称 取葛根素对照品适量，精密称定，加甲醇制成浓度为655 μg/mL的溶液，即得。

黄芩苷：精密称取黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成浓度为230.4 μg/mL的溶液，即得。

(3)色谱条件

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：丹参酮ⅡA乙腈-0.02%磷酸，按表3中的规定进行梯度洗脱；丹酚酸B乙腈-0.1%磷酸溶液(22:78)；毛蕊异黄酮葡萄糖苷乙腈-0.2%甲酸溶液，按表4中的规定进行梯度洗脱；葛根素0.1%枸椽酸溶液-甲醇，按表5进行梯度洗脱；黄芩苷甲醇-水-磷酸(47:53:0.2)；柱温为30 ℃；流速为1 mL/min；检测波长：丹参酮ⅡA为270 nm；丹酚酸B为286 nm；毛蕊异黄酮葡萄糖苷为260 nm；葛根素为250 nm；黄芩苷为278 nm；进样量：10 μL。

表3 丹参酮梯度洗脱表

表4 毛蕊异黄酮葡萄糖苷梯度洗脱表

表5 葛根素梯度洗脱表

(4)含量测定：分别精密吸取各对照品溶液及供试品溶液各10 L，注入液相色谱仪，按照相应色谱条件进行含量测定。分别计算样品中丹参酮ⅡA、丹酚酸B、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、葛根素、黄芩苷的含量。

(5)线性关系考察

分别取丹参酮ⅡA及丹酚酸B、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、葛根素、黄芩苷对照品溶液各2、4、6、8、10 μL，分别注入液相色谱仪，按照各自含量测定方法进行检测。分别以各对照品溶液浓度(μg/mL)为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，计算回归方程。得丹参酮IIA线性回归方程是y=59208x+2719.9，R2=1；丹酚酸B的线性回归方程是y=4459.8x-1460.2，R2=0.9999；毛蕊异黄酮葡萄糖苷的线性回归方程是 y =37463x+27024，R2=0.9978；葛根素的线性回归方程是 y=40647x-140295，R2=0.9998；黄芩苷的线性回归方程是 y=25499.1x-4711.1，R2=0.9999；标准曲线如图1～图5所示。

图1 丹参酮IIA标准曲线

图2 丹酚酸B标准曲线

图3 毛蕊异黄酮葡萄糖苷标准曲线

图5 黄芩苷标准曲线

(8)综合评分

由于实验的指标较多，按照每个指标占比20%，各项指标总分为20分。对各指标进行综合评分，并将各个指标综合评分做为这个试验的总指标。以此利用多指标综合评分法对实验结果作进一步的分析，寻找出最优的方案或工艺条件。

综合指标=(20/最大丹参酮含量值)×丹参酮含量值+(20/最大丹酚酸B含量值)×丹酚酸B含量值+(20/最大毛蕊花酮苷含量值)×毛蕊花酮苷含量值+(20/最大葛根素含量值)×葛根素含量值+(20/最大黄芩苷含量值)×黄芩苷含量值

1.4.2 水提部位有效成分含量测定[9-11]

(1)供试品溶液制备：取水提滤液做测定供试品溶液。

(2)对照品溶液的制备

芦丁：精密称取芦丁对照品20 mg，置100 mL容量瓶中，加95%乙醇50 mL使溶解，然后加50%乙醇稀释至刻度，即得0.2 mg/mL的对照品溶液。

黄芪甲苷：精密称取黄芪甲苷对照品5.65 mg置25 mL容量瓶中，加无水甲醇使溶解，然后加无水甲醇定容，即得0.226 mg/mL的对照品溶液。

无水葡萄糖：精密称取无水葡萄糖对照品制成浓度为1 mg/mL的对照品溶液。

(3)标准曲线的制备

总黄酮含量测定以芦丁为对照绘制标准曲线；总皂苷含量测定以黄芪甲苷为对照绘制标准曲线；总多糖含量测定以无水葡萄糖为对照绘制标准曲线。具体方法如下。

①总黄酮标准曲线的制备：精密量取芦丁对照品溶液0、1、2、3、4、5 mL，分别置于10 mL容量瓶中，各加50%乙醇溶液使成5 mL，精密加入5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min，加入10%硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀，再放置6 min，加入4%氢氧化钠溶液4 mL，分别用50%乙醇稀释至刻度，摇匀，放置15 min。以第一瓶作空白，用可见分光光度计在510 nm处测其吸光度，作标准曲线。总黄酮含量的线性回归方程是：y=16.041x+0.0457，R2=0.9966，标准曲线线如图6所示。

图6 总黄酮含量标准曲线

②总皂苷标准曲线的制备：精密吸取黄芪甲苷标准溶液0、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.45 mL于试管中，将溶剂蒸干，加新鲜配制的5%香草醛5 mL(称取5 g香草醛加冰醋酸100 mL定容至100 mL容量瓶中)和0.8 mL高氯酸，于70 ℃水浴中加热15 min，冷却精密加入冰醋酸5 mL摇匀后在30 min内用紫外分光光度计，在578 nm波长处测定吸光度。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制校准曲线及回归方程。总皂苷含量的线性回归方程是y=19.189x-0.0068，R2=0.9937；标准曲线如图7所示。

图7 总皂苷含量标准曲线

图8 总多糖含量标准曲线

③总多糖标准曲线的制备：精密量取无水葡萄糖对照品储备液 0、1、2、3、4、5 mL 分别置于 50 mL量瓶中用水定容，分别取上述溶液各 2 mL 稀释液于试管中，迅速加入 1 mL 6% 苯酚，5 mL浓硫酸，静置 5 min 后置于40 ℃水浴加热 15 min，再放入冰水中冷却，静置至常温50%乙醇定容至10 mL, 摇匀。在 490 nm 处测定其吸光度，据浓度与吸光度绘制校准曲线及回归方程。总多糖含量的线性回归方程是y=60.074x+0.0721,R2=0.9882；标准曲线如图8所示。

(4)含量测定

精密量取水提取液1 mL，3份，分别置于10 mL容量瓶中，分别按照1.4.2(S3)项下①②③标准曲线绘制的方法操作测定吸光度，分别代入标准曲线求浓度，并计算样品中总黄酮、总皂苷、总多糖的含量。

(5)干膏率[12]

精密吸取提取液10 mL，分别置于已烘至恒重的蒸发皿(105 ℃，恒重2 h)，蒸发溶剂至微量水分后，移入恒温干燥箱恒重3 h后，置干燥器内30 min,称定质量并计算干浸膏得率(两次称量结果误差不得超过5 mg)。

干膏率=干膏重量×5/净药材投入量×100%

(6)综合评分

由于实验的指标较多，按照每个指标占比25%，各项指标总分为25分，对各指标进行综合评分，并将各个指标综合评分做为这个试验的总指标。以此利用多指标的综合评分法对实验结果作进一步的分析，寻找出最优的方案或工艺条件。

综合指标=(25/最大总黄酮含量值)×总黄酮含量值+(25/最大总多糖含量值)×总多糖含量值+(25/最大总皂苷含量值)×总皂苷含量值+(25/最大干膏率值)×干膏率值

2 结果与讨论

2.1 乙醇回流提取工艺优化结果分析

采用L9(34)正交表安排试验，分别测定丹参酮ⅡA及丹酚酸B、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、葛根素、黄芩苷含量，计算综合得分。正交试验结果见表6，方差分析见表7。

表6 醇提正交试验结果直观分析表

表7 方差分析表

由直观分析表可知，各因素作用的主次顺序依次为提取时间(C)>料液比(B)>乙醇浓度(A)，说明提取时间对提取效果的影响最大，其次为料液比及乙醇浓度，由此得出的最佳工艺为 A3B2C3。故最终确定的醇提最佳工艺为A3B2C3，即乙醇浓度80%，料液比为1:15，提取2.5 h。由方差分析表可知，A、B、C三个因素对实验结果的综合评分的影响都不显著，究其原因可能是本实验误差大而自由度小(仅为2)，使实验的灵敏度低，从而掩盖了考察因素的显著性。

2.2 水回流提取工艺优化结果分析

采用L9(34)正交表安排试验，测定总黄酮含量、总皂苷含量、总多糖含量及干膏率，计算综合得分。正交试验结果见表8，方差分析见表9。

表8 水提正交试验结果直观分析表

表9 方差分析表

由直观分析表可知，各因素作用的主次顺序依次为加水量(B)>浸泡时间(A)>提取时间(C)，说明加水量对提取效果的影响最大，其次为浸泡时间及提取时间，由此得出的最佳工艺为A1B2C2。故最终确定的水提最佳工艺为A1B3C2，即浸泡1.5 h，加20倍量水，提取1.5 h。由表6可知三个因素对实验结果的综合评分的影响都不显著，究其原因可能是本实验考察指标较多，使实验的灵敏度低，从而掩盖了考察因素的显著性。

2.3 验证试验结果分析

按处方比例，取丹参、黄芪、茯苓、山药等十种中药粗粉，按照1.3.1项下提取工艺流程，分别采用醇提和水体法。醇提法按照加入15倍量的80%乙醇，浸泡15 min，90 ℃提取2.5 h工艺进行；水提法按照加20倍量水，浸泡1.5 h，100 ℃提取1.5 h进行。醇提液及水提液分别定容至50 mL，备用。重复实验2次。个有效成分测定结果结果见表10和表11。

表10 醇提验证实验结果表

表11 水提验证实验结果表

验证实验有效成分含量与正交试验结果最大提取率相差不大，说明结果稳定可靠。

3 讨 论

中药方剂“丹芪糖脂清颗粒剂”处方由10味药组成，有效成分较为复杂，在提取过程中不确定因素众多，如浸泡时间、提取时间、液料比、温度、提取次数等都各不相同，这些因素会对有效成分有一定影响。因此以各种能发挥药效的有效成分为指标，多指标综合测评实验结果，来确定较为科学可靠的最优提取工艺。传统的水煎煮法提取复方时，由于药材较多、成分复杂，药材中不易溶于水的成分难以被充分提取，且某些药物含有挥发油(如丹参中的丹参酮)，水煎煮 提取容易使有效成分挥发。而本文采取醇水双提法，能更好的提取脂溶性成分和易挥发成分。采取回流提取较其他提取方法而言，更加容易操作，对于工业化生产也更加经济。提取所选用的溶剂为乙醇和水，价格便宜，安全无毒，对人体无害。

4 结 论

本文通过在单因素实验的基础上进行的正交试验优选出的丹芪糖脂清颗粒提取工艺，得到最佳提取条件：乙醇回流提取丹参、黄芪、葛根、黄芪时，乙醇浓度80%，料液比为1:15，提取2.5 h时，醇提效果最佳；水回流提取茯苓、山药、山楂、决明子、柴胡、玉米须时，当浸泡时间为1.5 h，加水量为20倍，提取时间为1.5 h时，水提效果最佳。