子宫内膜癌中EME1基因表达及潜在机制的生物信息学分析

李瑞，张文艺，应彦祺，鲁笑钦

（郑州大学第二附属医院 妇产科，河南 郑州 450014）

子宫内膜癌是发达国家最常见的妇科恶性肿瘤，发病率呈上升趋势。尽管子宫内膜癌患者总生存率相对较高，并且约50%的高危患者不会复发，但是仍有10%～15%的低危患者会复发［1］。肿瘤的病理分型、分级、患者的临床因素都会影响到疾病预后。即使是同一组织类型，也会存在不同的疾病预后。随着精准医学推进，研究者们越发关注子宫内膜癌在分子层面的改变。2013年基于美国癌症基因图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据，子宫内膜癌分为POLE突变型、微卫星不稳定型、低拷贝型、高拷贝型［2］。现今基于转录组学、基因组学和蛋白质组学将子宫内膜癌分类为POLE突变型、错配修复缺陷型、非特异型、p53突变型［3］。研究者们越来越关注子宫内膜癌分子层面的差异，旨在进一步对癌症进行分类，为患者带来更为精准且个体化的治疗方案。

基因组不稳定性（genomic instability，GI）是癌症进化的基础，与耐药性和预后不良有关［4］。染色体不稳定可导致细胞的基因组改变，从而无限制地促进细胞增殖［5］。DNA错配修复（mismatch repair，MMR）基因在维持基因组稳定方面起着重要作用。MMR基因突变破坏了其错配修复功能，导致基因组不稳定，并导致以林奇综合征为代表的基因突变携带者患癌症的风险增加［6］。林奇综合征与子宫内膜癌的遗传易感性相关，因为由于DNA错配修复基因突变导致相应蛋白质表达差异，影响基因组的稳定性［7］。

减数分裂结构特异性核酸内切酶1（essential meiotic structure－specific endonuclease 1，EME1）基因对于维持基因组稳定性起到重要作用，EME1缺失可导致DNA损伤后姐妹染色单体的交换增加［4］。有研究发现对于EME1缺失的胚胎干细胞其姐妹染色单体交换是野生型胚胎干细胞的2倍，EME1在胃癌中高表达，其表达水平与胃癌的分化水平和淋巴转移相关，敲降EME1表达显著抑制胃癌的增殖、迁移和侵袭能力，促进细胞凋亡和细胞周期阻滞［8］。在乳腺癌中，EME1高表达与患者不良预后相关［9］。但是EME1目前与子宫内膜癌的关系尚不明确。本研究通过生物信息学技术分析EME1在子宫内膜癌中的表达、与患者预后的关系及潜在作用机制，拟为深入研究奠定基础。

1 资料与方法

1.1 EME1在子宫内膜癌中的表达及预后分析使用在线工具UALCAN（http：／／ualcan.path.uab.edu／index.html）分析EME1 mRNA表达水平，该网站收录了子宫内膜癌样本546例，正常子宫内膜样本35例。使用Kaplan Meier plotter数据库（http：／／kmplot.com／analysis／）对EME1进行生存分析，该网站收录子宫内膜癌样本543例，依据EME1 mRNA表达水平中位值进行分组，分为高表达组和低表达组，进行总生存率（overall survival，OS）及无复发生存率（relapse－free survival，RFS）分析。

1.2 EME1相关基因使用在线工具STRING（https：／／cn.string－db.org／）进行蛋白质互作（proteinprotein interaction，PPI）分析，寻找与EME1蛋白紧密关联的基因，设置物种为智人，选择最高关联度0.900，选取与EME1关系最为密切的前10位基因。

1.3 EME1及相关基因的富集分析使用DAVID网站（https：／／david.ncifcrf.gov／）对EME1及10位相关基因进行富集分析，探索EME1及其相关基因的生物学功能。选取包含EME1的富集结果，当P＜0.05且FDR＜0.05被认为是显著富集，差异有统计学意义。

1.4 EME1的甲基化水平及拷贝数使用在线工具UALCAN（http：／／ualcan.path.uab.edu／index.html）分析EME1基因启动子甲基化水平。使用cBioPortal数据库（https：／／www.cbioportal.org／）对EME1基因进行拷贝数变异分析。

1.5 EME1潜在转录因子使用hTFtarget在线工具（http：／／bioinfo.life.hust.edu.cn／hTFtarget／＃！／）预 测基因潜在的转录因子及结合位点，组织限定为子宫内膜。使用在线工具UALCAN分析转录因子的表达水平，使用Kaplan Meier plotter数据库对转录因子进行生存分析，使用cBioPortal数据库（https：／／www.cbioportal.org／）对EME1与潜在转录因子进行相关性分析。

2 结果

2.1 EME1在子宫内膜癌中高表达且不利预后通过在线工具UALCAN分析EMEI在子宫内膜癌中的表达，结果表明相较于正常子宫内膜组织，EME1在子宫内膜癌中高表达（P＜0.001）（图1A）。临床病理分析发现，EME1的表达与肿瘤分期无关（图1B），与肿瘤病理分型有关（图1C）。EME1在浆液性癌（P＜0.001）及混合型癌（P＝0.044）中的表达水平高于子宫内膜样癌。通过Kaplan－Meier plotter数据库绘制EME1生存曲线，发现EME1与子宫内膜癌患者总生存率（图2A）及无复发生存率（图2B）相关，可作为潜在的不良预后因子。EME1表达水平越低，患者总生存率（P＝0.001）及无复发生存率（P＝0.018）越高。

图1 EME1在子宫内膜癌中的表达情况

图2 EME1与子宫内膜癌患者生存率关系

2.2 EME1及其相关基因EME1基因可以翻译成蛋白质行使生物学功能。因此，通过STRING数据库对EME1进行蛋白质互作分析查找最密切相关的前10位蛋白，其基因名分别为BRCA1、TOP3A、RAD51、SLX4、ERCC4、MUS81、EXO1、RMI1、RMI2、BLM（图3）。对EME1及10位相关基因共同进行GO富集分析和KEGG通路富集分析发现，这些基因集中在“核质”“霍利迪连接体解离酶复合物”等细胞组分，涉及“DNA结合”“脱氧核糖核酸内切酶”等分子功能，“DNA修饰”“链间交联损伤修复”等生物过程，“范可尼贫血途径”“同源重组”等信号通路（表1）。

表1 EME1的GO和KEGG富集分析

图3 EME1密切相关的10个蛋白

2.3 EME1机制探索为了进一步探索子宫内膜癌中EME1高表达的潜在机制，使用UALCAN数据库对EME1基因启动子甲基化分析，发现正常子宫内膜与子宫内膜癌的甲基化水平差异无统计学意义（P＝0.160）（图4A）。但是通过cBioPortal数据库分析发现，在子宫内膜癌患者中，当EME1基因拷贝数值越大，EME1 mRNA表达量越高（r＝0.260，P＜0.001）（图4B）。

图4 EME1基因表达状态

使用hTFtarget预测EME1潜在转录因子，发现目标转录因子ESR1。ESR1蛋白与EME1 DNA序列存在潜在结合位点，该位点位于17号染色体，范围50 372 893～50 373 256，峰位于启动子区域，峰富集分数为17.4，距离EME1转录起始位点上游327碱基对（图5）。通过UALCAN表达分析发现，ESR1在子宫内膜癌中低表达（P＜0.001）（图6A）。对ESR1进行预后分析发现，ESR1高表达与子宫内膜癌患者总生存率高相关（P＜0.001）（图6B），与无复发生存率高相关（P＝0.031）（图6C）。使用cBioPortal数据库对EME1与ESR1进行相关性分析发现，ESR1 mRNA与EME1 mRNA二者在子宫内膜癌中呈现负相关（r＝－0.280，P＜0.001）（图6D）。

图5 EME1潜在转录因子预测

图6 ESR1 mRNA表达水平、对生存率的影响及其与EME1 mRNA表达水平的关系

3 讨论

EME1位于17q21.33（第17号染色减数分裂结构体长臂2区1带3亚带3次亚带），可编码蛋白质。EME1蛋白可以与特定的DNA结构相互作用，例如霍利迪连接体、3’末端翘翼（3’flap）结构、异常复制叉结构［10－11］，该蛋白可能影响DNA损伤修复并保持基因组稳定性［4］。Weinandy等［12］发现原发性人胶质细胞瘤中西妥昔单抗可以通过提高EME1的表达水平促进DNA修复，进而达到抗癌效用。EME1自身外显子突变影响体内EME1表达水平，中国南方女性的EME1 Ile350Thr变异与乳腺癌的易感性和早发显著相关，其过度表达可导致乳腺癌的顺铂耐药［13］。然而，目前EME1在子宫内膜癌中的作用机制目前尚不明确。本研究利用生物信息学探索EME1与子宫内膜癌的相关性，为未来的机制探索提供研究基础。

Tomoda等［14］对多种癌细胞株检测发现，EME1低表达的肿瘤对化疗药敏感性更强，子宫内膜癌细胞株AN3CA中EME1是高表达，但是并未检测人子宫内膜癌组织中EME1的表达状况。UALCAN网站汇集了TCGA数据库546例人子宫内膜癌和35例人正常子宫内膜样本的mRNA测序数据，经生物信息分析发现EME1 mRNA在子宫内膜癌患者中高表达，其中浆液性子宫内膜癌与混合型子宫内膜癌中EME1 mRNA的表达水平高于子宫内膜样癌。进行预后分析发现，EME1基因高表达与子宫内膜癌不良预后相关。利用蛋白质相互作用原理，寻找与EME1蛋白关系最为密切的10个蛋白，进行富集分析。10个蛋白分别是BRCA1、TOP3A、RAD51、SLX4、ERCC4、MUS81、EXO1、RMI1、RMI2、BLM。BRCA1是一种同源重组修复蛋白，维持染色体稳定性。Nahshon等［15］研究发现在BRCA1／2突变的人群中子宫内膜癌发病风险增加2～3倍，子宫内膜浆液性癌发病风险增加12～13倍。BLM－TOP3A－RMI1／2溶解酶复合物与端粒延长替代通路中C环形成有关［16］。子宫内膜癌患者BLM Ash杂合突变率高于正常人群［17］。EME1蛋白可以与MUS81蛋白组合成异源二聚体，发挥核酸内切酶活性［18］。RAD51可抑制MUS81－EME1对DNA 3’末端翘翼的切割作用［19］。RAD51在各种肿瘤中过表达导致错误的DNA双链修复，可促进肿瘤的进展与转移。RAD51基因多态性与子宫内膜癌的发生有关［20］。SLX4蛋白是用于组装SLX1－SLX4－MUS81－EME1－XPF－ERCC1（SMX）三核酸酶复合物的支架，SMX促进DNA 同源重组修复［21］。SLX4也可与XPFERCC4核酸内切酶复合体的亚基结合，奠定DNA链间交联损伤修复的基础［22］。EXO1是一种DNA核酸外切酶，与双链断裂修复、错配修复、端粒维持有关［23］。富集分析结果显示它们主要涉及霍利迪连接体、DNA修复、范可尼贫血途径等。富集分析的结果与EME1现有研究所揭露的功能是相符的。上述分析结果可为探索子宫内膜癌中EME1的作用机制铺垫基础。

利用生物信息技术对EME1作用机制进行上游追溯，发现子宫内膜癌细胞基因拷贝数增加与EME1高表达水平相关，同时发现EME1启动子的潜在转录因子ESR1。ESR1可编码雌激素受体α，经生物信息分析发现，ESR1在子宫内膜癌中低表达，与EME1表达呈负相关。根据现有分析结果进行推测：（1）高表达的ESR1可能对EME1启动子有负性调控作用，抑制EME1的表达，当ESR1低表达时，对EME1的抑制减少；（2）生物信息分析结果基于现有研究，具有一定的局限性，可能ESR1与其他转录因子竞争性结合，进而抑制EME1的表达。未来可以借助染色质免疫共沉淀测序技术探索EME1的潜在转录因子。

综上所述，围绕EME1进行了生物信息学分析，挖掘了10个相关基因，1个潜在转录因子，为接下来EME1具体作用机制的研究奠定了基础。同时也肯定了EME1与子宫内膜癌的相关性、重要性，展现了继续深入研究的价值，为未来子宫内膜癌患者的精准治疗提供研究基础。