响应面法优化-超声辅助提取黄芪多糖工艺

魏增云， 董芳娟， 薄一览

（1.忻州职业技术学院，山西 忻州 034000；2.忻州师范学院地理系，山西 忻州 034000）

黄芪（Radix Astragali）是豆科黄芪属植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根，是一味传统中药，也是保健食品的一种重要原料[1]。黄芪蕴含皂苷、黄酮、多糖等化学成分[2]，具有敛疮生肌、利尿托毒、止汗退肿等功效[3]。黄芪多糖提取自黄芪，可溶于水[4]，是黄芪发挥生物活性和药理作用的重要物质之一。研究证实，黄芪多糖具有抑制结直肠癌细胞的侵袭和迁移[5]、提高机体抗氧化能力、增强机体免疫力、拮抗镉毒性[6]、保护牙周组织完整性[7]、促进重离子辐射细胞的生长、有效减轻细胞基因组DNA及染色体的损伤水平[8]等作用，因此，开发黄芪多糖的提取方法具有重要意义。

目前，黄芪多糖的提取方法主要有溶剂法、酶辅助法、微生物发酵法和电磁强化法[9]。由于工艺条件等因素，溶剂法是工业上黄芪多糖提取的常用方法，但溶剂法不仅提取率低[10]，还存在着耗时、耗能、易使活性成分失活等弊端，因此，黄芪多糖的提取方法成为黄芪多糖开发利用的瓶颈。酶辅助法对环境要求高，微生物发酵法中菌种选育困难[9]，因此不适于工业生产。电磁强化法中的超声辅助法是利用超声波的空化作用使溶剂渗入植物细胞，且使细胞中的有效成分快速进入溶剂。超声波产生的击碎效应能有效提高细胞破碎效率，加速细胞内有效成分的扩散和释放，从而有效提高多糖提取率。超声辅助法具有快速、低温等特点，且有利于维持有效成分的生物活性，因此，适合于动植物多糖工业生产的研发。但超声波强烈的机械振动也可能会破坏多糖结构。因此，本试验拟采用低频超声功率，以山西省忻州市五寨县人工种植蒙古黄芪的干燥根为原料，研究超声辅助提取法提取黄芪多糖的工艺条件，以期为山西本地黄芪资源的高植化利用提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

以山西省忻州市五寨县种植的蒙古黄芪干燥根为研究材料，购自五寨县正和堂药材公司；将试验材料干燥、粉碎过40目筛，封存待用。

设备：KQ-100DB型数控超声波设备（昆山市超声仪器有限公司），工作频率40 kHz，功率100 W；752N型紫外可见分光光度计（上海津科）。所用试剂均为国产分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 标准曲线的制作 取7支25 mL比色管，制成2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5 µg·mL-1的葡萄糖标准液，然后加入5%的苯酚溶液1 mL、浓硫酸5 mL，摇匀，静置5 min，以2 mL蒸馏水作空白对照。将此8支比色管开盖置于沸水浴15 min后取出，冷却至室温，在490 nm处测量其吸光值。以葡萄糖浓度为横坐标，吸光值为纵坐标制作标准曲线，得到回归方程为Y=0.032 0X+0.061 2，R2=0.995 9。多糖得率按照以下公式进行计算。

1.2.2 黄芪多糖的提取和测定 精确称取0.5 g干燥的黄芪粉于50 mL三角瓶中，按液固比加一定体积的蒸馏水，超声（超声功率、温度、液固比、提取时间和提取次数）提取黄芪多糖，静置后去沉淀，定容至2 000 mL，测定黄芪多糖含量。

1.2.3 超声辅助提取黄芪多糖工艺的优化 设置单因素试验，分别研究超声功率、温度、液固比、提取时间和提取次数对黄芪多糖得率的影响。其中，超声功率单因素试验：温度55℃，液固比40 mL·g-1，提取时间30 min，提取次数2次，设置超声功率分别为20、40、60、80和100 W；温度单因素试验：超声功率80 W，液固比40 mL·g-1，提取时间30 min，提取次数2次，设置温度分别为35、45、55、65和75℃；液固比单因素试验：超声功率80 W，温度55℃，提取时间30 min，提取次数2次，设置液固比分别为20、30、40、50和60 mL·g-1；提取时间单因素试验：超声功率80 W，温度55℃，液固比50 mL·g-1，提取次数2次，设置提取时间分别为10、20、30、40和50 min；提取次数单因素试验：超声功率80 W，温度55℃，液固比50 mL·g-1，提取时间20 min，设置提取次数分别为1、2和3次。

1.2.4 响应面试验设计 在单因素试验基础上，选择对黄芪多糖提取有显著影响的因素：超声功率、温度、液固比和提取时间4个因素为考察对象，以黄芪多糖得率为响应值，采用Design-Expert 8.0.6 Trial统计分析方法，设计四因素三水平回归试验（表1）。

表1 响应面分析因素与水平Table 1 Analytical factors and levels for response surface methodology

2 结果与分析

2.1 超声辅助提取黄芪多糖工艺的优化

超声功率、温度、液固比、提取时间和提取次数5个因素对黄芪多糖的提取率有显著影响（表2）。不同超声功率、温度、液固比、提取时间所得的多糖得率存在极显著差异；不同提取次数所得的多糖得率差异显著。随着功率的增加，黄芪多糖得率先增加后降低，功率为80 W时黄芪多糖得率最高，可能是由于功率过大破坏了多糖结构[11]，因此，80 W为黄芪多糖超声提取的最佳功率。随着提取温度的升高，黄芪多糖得率也呈先升高后降低趋势，当提取温度为55℃时黄芪多糖得率最高，温度继续升高后多糖得率显著降低，可能是由于温度过高导致多糖降解[12]，因此，55℃为黄芪多糖超声提取的最佳提取温度。随着液固比的增加，黄芪多糖得率先升高后降低，液固比为50 mL·g-1时多糖得率最高。随着提取时间的增加，黄芪多糖得率先升高后降低，在提取时间为20 min时最高，继续延长时间，多糖得率反而降低，30 min后下降更为明显，这可能是由于处理时间太长，超声波使黄芪多糖发生断裂[13]，因此，20 min为最佳提取时间。随提取次数的增加，黄芪多糖得率逐渐增加，提取次数为3次时，黄芪多糖得率最高，但提取次数为2次和3次间多糖得率差异不显著，且提取3次时成本太高，因此，提取次数为2次最佳。

表2 不同处理下的黄芪多糖得率Table 2 Yield of astragalus polysaccharides under different treatments

2.2 响应面分析

2.2.1 回归分析 根据表1设计的因素及水平，按表3方案实施试验，共24个析因点，5次零点试验，得出各个试验条件的黄芪多糖得率。不同试验条件所得黄芪多糖得率差异极显著（F=31.81，P＜0.01）。软件经无量纲线性编码代换模拟出回归方程。

表3 响应面分析Table3 Analysis of response surface methodology

式中，A代表超声功率；B代表温度；C代表液固比；D代表提取时间。由此表明，超声功率、温度、液固比和提取时间4因素对黄芪多糖得率的影响依次为：超声功率＞温度＞液固比＞提取时间。

2.2.2 方差分析 方差分析（表4）表明，模型的F值为15.35，P＜0.000 1，表明该回归方程的拟合度良好。A、B、A2、B2、C2和D2的P值均小于0.05，说明模型项显著。失拟项的F值为31.99，表明模型适合度显著。模型调整后的相关系数R2为0.877 7，变异系数为2.53%，表明试验的可靠性高，实验操作可靠。该模型的确定系数R2为0.938 8，表明多糖得率的实测值与预测值间的拟合度较好，该模型可用于黄芪多糖得率的预测。

2.2.3 响应面分析 为了更明确超声功率、温度、液固比、提取时间对黄芪多糖得率的交互关系，采用Design-Expert 8.0.6 Trial软件对表4数据进行多元回归分析，结果（图1）表明，超声功率与温度和提取时间交互作用不显著；温度与液固比和提取时间交互作用显著。因此，经过中心组合设计对提取条件进行优化，超声辅助提取法提取黄芪多糖工艺的最佳提取参数为：超声功率80.3 W，温度56.1 ℃，液固比49.02 mL g-1，提取时间20.8 min，此时多糖得率可达到5.468%。验证性试验（超声功率80 W，温度55℃，液固比50 mL·g-1，提取时间20 min）表明，黄芪多糖得率为5.40%，与理论值相符。因此，采用响应面法得到的提取条件相对可靠，具有一定的应用价值。

图1 不同影响因素对黄芪多糖得率的交互关系Fig.1 Interaction relation of different influencing factors on the yield of astragalus polysaccharides

表4 拟合二次多项式模型的方差分析Table 4 Variance analysis of fitting quadratic polynomial model

3 讨论

黄芪多糖是黄芪中的有效活性成分[5-8]，将黄芪多糖开发为药物或保健产品逐渐成为一种研究趋势。本研究对黄芪多糖的超声辅助提取工艺进行了优化，结果表明，超声功率、反应温度和提取时间都不宜过高，超过一定阈值可能会破坏黄芪多糖结构而使得多糖得率降低，与前人研究结果一致[11-13]；液固比增大，多糖得率也随之升高，可能是由于细胞内外浓度梯度的增大有利于细胞内多糖的析出，但液固比高于50 mL·g-1后，多糖得率反而降低。进一步利用响应面优化法研究超声功率、反应温度、液固比和提取时间对黄芪多糖得率影响的强弱关系表明，超声功率＞温度＞液固比＞提取时间；因素间的互作表明，超声功率与温度和提取时间交互作用不显著，温度与液固比和提取时间交互作用显著。因此，超声辅助提取黄芪多糖工艺最佳提取条件为：超声功率80 W，温度55 ℃，液固比50 mL·g-1，提取20 min。按照此条件进行提取，山西五寨人工种植黄芪的多糖得率可达5.40%。梁子敬等[14]研究表明，超声辅助提取黄芪多糖的适宜参数为：功率600 W，温度80 ℃，液固比22 mL·g-1，提取87 min，黄芪多糖得率为6.07%。与其相比，本研究采用低频超声波，节能的同时更有效地减少了噪声污染，且提取时间更短，反应温度更易控制，液固比较高，可能是由于较高的液固比增加了细胞内外浓度差，更有利于多糖的析出。本试验用时仅为水提工艺[15]的33%、碱水提工艺[10]的4.44%，显著缩短了提取时间；相较超声辅助碱水提取法[2]和微波辅助提取法[16]，操作简单易控，不用预处理及控制pH，无废渣废液，节能环保。