微波辅助法提取竹叶花椒黄酮的结构特征

何鑫柱，李潮俊，陈凯，康明，梁晓峰*

1. 西南科技大学材料科学与工程学院（绵阳 621010）；2. 四川中医药高等专科学校川西北中药材资源研究与开发利用实验室（绵阳 621010）

竹叶花椒（Zanthoxylum armatumDC.）为芸香科花椒属植物，主要分布在中国西南、华中、华北和华东等地区，其根、茎、叶、果实、种子均可入药，主治胃腑冷痛，风湿关节等[1]。竹叶花椒中含有挥发油、黄酮、木质素、生物碱等活性成分[2]，具有抗氧化、抗癌、降血糖、降血脂、抗衰老等药理功效[3-5]。其中的黄酮类物质是天然多酚类化合物，具有多种生物活性。黄酮类化合物的结构中，2个苯环通过1个C3部分联结形成C6—C3—C6骨架，由于联结方式、连接位置、氧化水平及聚合程度等不同，使得黄酮类化合物分子结构丰富多样，理化性质及生物活性表现各不相同[6-7]。利用现代分析测试技术对黄酮类物质结构和性能进行表征研究是黄酮研究和开发利用的重要内容，随着现代分离技术和结构测定手段发展，许多新的黄酮类化合物得以发现[8]。近年来，对竹叶花椒的活性成分提取及其药用性能等开展较多研究[9-10]，对竹叶花椒中总黄酮的提取、分离研究取得积极进展。利用微波辅助提取法获得提取黄酮类物质的工艺参数。

对微波辅助法提取竹叶花椒总黄酮进一步研究分析，用聚酰胺-大孔吸附树脂联用的方法纯化竹叶花椒中的总黄酮，利用现代分析测试技术研究竹叶花椒黄酮的谱学特征、显微形貌、热稳定性等特征，对丰富黄酮类物质结构和性能数据及竹叶花椒综合开发利用具有参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

干燥的竹叶花椒果皮（成都蜀荆味商贸有限公司）；95%乙醇、石油醚（分析纯，成都市科隆化学品有限公司）；聚酰胺（0.250～0.600 mm，即30～60目）、D101大孔吸附树脂（上海麦克林生化科技）。

1.2 仪器与设备

Sartorius BSA124S分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；RE52CS-2旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；YTLG-12A冷冻干燥机（上海叶拓科技有限公司）；XH-MC-1实验室微波合成仪（祥鹄科技）；DHG-9075A电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；UV-315紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；Nicolet-5700红外吸收光谱（美国热电仪器有限公司）；RF-6000荧光光谱仪（日本日立公司）；X Pert pro X-射线衍射仪（荷兰帕纳科）；UItra55高分辨冷场发射扫描显微镜（德国卡尔·蔡司NTS有限公司）；SDT Q160热分析仪（美国TA仪器公司）。

1.3 方法

1.3.1 竹叶花椒中黄酮的提取

将竹叶花椒果皮用粉碎机粉碎，称取适量粉末，加入原料30倍的60%乙醇溶液，用微波辅助法提取，提取温度80 ℃，提取时间25 min，微波功率400 W，提取液先进行抽滤，滤液用旋转蒸发仪进行浓缩，用石油醚进行脱脂处理[11]，冷冻干燥得到黄酮粗提物；用聚酰胺-大孔吸附树脂联用的方法进行纯化[12]，得到淡黄色粉末状黄酮纯化物。

1.3.2 紫外可见光谱测试

分别称取黄酮粗提物黄酮纯化物适量，用60%乙醇溶液溶解，利用UV-315紫外可见分光光度计扫描，扫描范围为200～800 nm。

1.3.3 红外吸收光谱测试

利用Nicolet-5700红外光谱仪扫描制备好的黄酮粗提物与纯化物的溴化钾片，分辨率0.4 cm-1，扫描波长范围为400～4 000 cm-1。

1.3.4 X-射线衍射测试利用X Pert pro X-射线衍射仪对制备好的黄酮粗提物和纯化物进行测试，其扫描角度3°～80°。

1.3.5 扫描电镜测试

将黄酮粗提物和纯化物粉末用导电胶固定在样品台上，进行喷金处理，利用UItra55高分辨冷场发射扫描电子显微镜对其形貌进行观察。

1.3.6 荧光光谱测试

分别称取黄酮粗提物和纯化物适量，用60%乙醇溶液溶解，利用RF-6000荧光光谱仪进行测试，激发光波长365 nm，扫描范围为385～710 nm。

1.3.7 热重测试

利用SDT Q160热分析仪对黄酮粗提物和纯化物进行测试，测试氛围为N2，N2流速100 mL/min，升温范围为室温-800 ℃，升温速率10 ℃/min。

2 结果与分析

2.1 竹叶花椒黄酮的紫外可见光谱

竹叶花椒黄酮粗提物与纯化物的紫外可见光谱图如图1所示。粗提物的吸收峰位于259.5，269.5，279.5和328 nm，其中259.5和279.5 nm为肩峰；粗提物的吸收带Ⅰ较弱，吸收带Ⅱ较强，在吸收带Ⅱ处伴有双肩峰，这可能是由于提取物中异黄酮或二氢黄酮等引起[13]。样品经纯化后，其紫外可见光谱主要有2个吸收峰，分别位于279和330 nm处，未见肩峰。黄酮类化合物具有C6—C3—C6这一基本结构，其紫外光谱在220～400 nm范围内一般有2个主要吸收带，峰带Ⅰ（300～400 nm）和峰带Ⅱ（220～280 nm），带Ⅰ主要是B环肉桂酰生色团的电子跃迁产生的吸收带，带Ⅱ主要是A 环的苯甲酰生色团的电子跃迁产生的吸收带[14]，由此推断竹叶花椒黄酮具有黄酮类化合物的紫外特征吸收峰。其中带Ⅰ内的吸收峰峰宽大而且不够尖锐，其造成的原因可能是提取物在300～400 nm内有吸收峰的物质较多，即B环取代基的位置复杂[15]。

图1 黄酮粗提物（a）与纯化物（b）的紫外可见光谱图

2.2 竹叶花椒黄酮的红外吸收光谱

竹叶花椒黄酮粗提物和纯化物的红外光谱图如图2所示。黄酮粗提物和纯化物的红外吸收特征峰相似，在3414 cm-1处有1个极强的吸收峰，这是酚羟基的特征谱峰[16]；2973 cm-1处为甲基C—H的反对称伸缩振动吸收峰；2928 cm-1处为亚甲基C—H的反对称伸缩振动吸收峰；1669 cm-1处为羰基C＝O的伸缩振动吸收峰[17]；1627，1518和1450 cm-1为苯环骨架的振动吸收峰；1385 cm-1处为甲基C—H的对称变角振动吸收峰；1300 cm-1以下，1284，1160，1048和955 cm-1等是糖环中的C—O的伸缩振动吸收峰；880，824和767 cm-1为芳环上CH的面外弯曲振动吸收峰。黄酮纯化物与粗提物相比，黄酮纯化物的红外光谱分辨率更高，特征官能团更加突出。

图2 黄酮粗提物（a）和纯化物（b）的红外光谱图

2.3 竹叶花椒黄酮的结晶性

竹叶花椒黄酮粗提物和纯化物平滑后的X-射线衍射图如图3所示。黄酮纯化物在23°附近有一个衍射强度弱的宽峰，这是一个典型的无定型粉末特征衍射峰，其他位置几乎没有衍射峰，由此推断黄酮纯化物为无定型粉末；黄酮粗提物在28.3°，40.5°和66.3°有强度弱的衍射峰出现，在23°附近有一个衍射强度弱的宽峰，也由此推断黄酮粗提物为无定型粉末。

图3 黄酮粗提物（a）和纯化物（b）的X-射线衍射图

2.4 竹叶花椒黄酮的微观形貌

竹叶花椒黄酮粗提物和纯化物的扫描电镜如图4所示。图4（a和b）分别是黄酮粗提物在500倍和5000倍下的微观形貌，图4（c和d）分别是黄酮纯化物在500倍和5000倍下的微观形貌。由图4可见，黄酮粗提物在高倍镜下可以明显地观察到片状、棒状、椭圆状和微球等结构。其中，片状、棒状、椭圆状的形貌不规整，尺寸大小不均一，主要在几个微米和几十个微米之间；微球状结构的形貌规整，但分布不均匀，尺寸大小约1 μm左右。黄酮纯化物在高倍镜下可以明显的观察其大部分都是形貌比较规整的微球，尺寸大小主要为1 μm左右，此外还具有薄膜状结构。

图4 黄酮粗提物（a和b）和纯化物（c和d）的扫描电镜图

2.5 竹叶花椒黄酮的发光特性

竹叶花椒黄酮粗提物和纯化物在365 nm激发波长下的荧光发射光谱图如图5所示。它们都具有2个明显的荧光发射峰，黄酮粗提物发射峰位分别在450 nm和670 nm；黄酮纯化物发射峰分别位于457 nm和667 nm。荧光是电子从第一激发单重态跃迁回基态所产生的降级辐射[18]，能强烈发光的分子几乎都是通过吸收π→π*跃迁而达到电子激发态的，一般只有那些具有共轭双键，尤其是具有刚性平面和多环结构的分子才有利于发光，黄酮是一类具有多环结构的物质，因此黄酮类物质会具有较强的荧光性能。黄酮纯化物的荧光性能比粗提物的强，这是由于黄酮纯化物中黄酮类物质的含量更高，具有多环结构的分子更多，更有利于发光。

图5 黄酮粗提物（a）和纯化物（b）的荧光发射光谱图

2.6 竹叶花椒黄酮的热稳定性

竹叶花椒黄酮粗提物和纯化物的热重（thermogravimetric，TG）和微商热重（derivative thermogravimetry，DTG）曲线见图6。由黄酮粗提物和纯化物主要有4个失重阶段，第1个阶段主要是提取物中吸附水和结晶水的损失[19]，第2个阶段主要是提取物中的一些黄酮类物质和其他有机物的分解，第3个阶段提取物的失重区间较短，失重率较低，可能是由于提取物中的某一种黄酮类物质分解导致，第4个阶段提取物在到达最快失重温度264 ℃后，失重率逐渐降低，这时提取物进入预碳化阶段[20]，具有较高热稳定性的黄酮类物质开始分解，温度达到700 ℃后质量变化不大，提取物在该温度下几乎完全碳化。黄酮纯化物的热稳定性比粗提物更好，残炭率分别为40.28%和34.09%。

图6 黄酮粗提物（上）和纯化物（下）的TG和DTG曲线

3 结论

运用现代分析测试技术对竹叶花椒黄酮粗提物和纯化物的结构与性能进行研究。紫外光谱表明黄酮提取物中有黄酮类物质的特征吸收带；红外光谱表明提取物中具有酚羟基、羰基和苯环等黄酮类物质的特征振动吸收峰；X-射线衍射图谱表明提取物为无定型粉末；扫描电镜表明提取物为1 μm左右的球状结构；提取物在365 nm激发波长下会在450 nm和670 nm左右分别发出蓝色和红色的荧光；纯化黄酮的加热失重率达60%，主要有4个失重阶段，最快失重温度为264 ℃。