超高压加工对牛奶微生物、热敏感指标及物理特性的影响

钱文涛，李洪亮，杨晋辉*，王孟辉，陈静，党云刚

1. 蒙牛高科乳制品（北京）有限责任公司（北京 101100）；2. 内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司（呼和浩特 011500）；3. 蒙牛乳业（北京）有限责任公司（北京 101100）

随着我国居民生活水平的逐步提高，人们对于营养摄入也逐渐重视起来。由于我国牛奶主产区域和消费区域的不平衡，加之冷链运输系统不完善，我国市场上牛奶产品以超高温瞬时灭菌乳（UHT）为主[1]。与巴氏杀菌工艺相比，UHT由于较高的热加工强度，其牛奶产品中乳铁蛋白、免疫球蛋白等对人体有益的活性蛋白含量较低[1]。为了降低乳制品加工过程的热损伤，非热杀菌的加工工艺成为了牛奶加工新的研究方向。超高压灭菌通过较高的静水压力，破坏微生物的菌体结构，达到杀菌目的，并最大限度地保留了食材原有的感官品质和营养价值[2]。此次试验目的在于筛选适用于生乳灭菌的超高压加工工艺条件，通过比较不同压力条件和维持时间的工艺组合，研究超高压对生乳中微生物、热敏感指标和物理特性的影响，为超高压牛奶产品的生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验分为两个部分。试验一用于筛选最优的加工条件，以微生物数量和热敏感指标分别作为安全指标和牛奶热损伤指标，对影响超高压加工效果的加工压力和维持时间的两个因素进行筛选，选择微生物数量最低和牛奶热损伤最小的加工压力时间组合，作为优化加工条件。试验二用于研究超高压加工对牛奶物理特性的影响，对不同加工压力和时间组合下加工牛奶以及生鲜乳的粒径、色差等指标进行对比分析。

1.2 样品加工

生乳样品由蒙牛乳业（太原）有限公司提供，采集奶罐车上的大罐样品，样品采集完成后，2 h内冷藏运送至三水河公司进行加工，加工设备为立式加压SSH试验机，容积8.8 L，压力舱温度设置为25 ℃。试验一中设备压力分别设置为200，400和600 MPa，维持时间分别是5，30和60 min，每个加工压力和时间的组合重复3次，即进行3个批次生乳的加工，共计30个样品（包括原奶）。样品一部分送至山西大学生命科学学院进行微生物学检测，另一部分冷冻保存，送至蒙牛中心实验室检测热敏感指标。试验二中采用试验一优化所得加工条件（600 MPa维持15 min），同时设置200 MPa维持15 min、400 MPa维持15 min、600 MPa维持5 min、600 MPa维持30 min等试验处理组，进行3批次加工试验，以生乳为对照组，共计18个样品。所有样品冷藏条件下运回蒙牛中心实验室，进行物理特性的检测。两次试验中生乳成分信息由蒙牛乳业（太原）有限公司提供，如表1所示。

表1 生鲜乳成分指标（平均值±标准差）

1.3 微生物和热敏感指标的检测

牛奶样品中微生物检测指标包括菌落总数、大肠菌群计数、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌，分别采用GB 4789.2—2016[3]、GB 4789.3—2016[4]、GB 4789.10—2016[5]和GB 4789.4—2016[6]方法进行平板检测，每个样品做2个重复。热敏感检测指标包括乳果糖、糠氨酸、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳过氧化物酶。乳果糖和糠氨酸的检测方法参照NY/T939—2016[7]。其中：糠氨酸的检测采用配有紫外检测器的高效液相色谱仪；α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的检测参照T/TDSTIA 007—2019[8]，检测设备为配备有紫外检测器的高效液相色谱仪；乳过氧化物酶的检测采用evergreen试剂盒（美国，EC401117）检测方法进行检测。

1.4 物理特性分析

加工牛奶物理指标的检测包括粒径和色差。利用Beckman Coulter LS13320激光粒度分析仪分析产品粒径分布，结果以颗粒粒径在不同尺度上的百分占比表示。色差分析通过X-riteRM200色差仪进行分析，将样品盛放于透明的样品瓶中，用校正过的色差仪光源贴到外瓶壁进行检测，整个操作在避光条件下进行，结果包括L、a、b3个参数，以生乳色泽为基准，其中：L为深浅指数，ΔL＞0，颜色偏浅，ΔL＜0，颜色偏深；a为红绿指数，Δa＞0，颜色偏红，Δa＜0，颜色偏绿；b为黄蓝指数，Δb＞0，颜色偏黄，Δb＜0，颜色偏蓝。

1.5 数据分析

试验一中，微生物数量经过log10转换后进行统计分析，微生物数量和热敏感指标含量以加工压力和时间作为模型主效应进行方差分析。试验二中，色差数据统计时以试验分组进行Anova分析。统计分析利用R软件（V 3.6.1）完成。粒径数据利用Unscrambler 10.4软件进行主成分分析，导出图示进行结果说明。

2 结果与讨论

2.1 微生物

试验中不同批次生鲜乳和加工乳中的微生物指标如表2所示。所有产品中的沙门氏菌均未检出。加工压力极显著影响了微生物的数量（p＜0.01）。当加工压力超过400 MPa时，加工中的微生物指标显著低于生乳；当加工压力为600 MPa时，样品中大肠杆菌未检出，三批次加工样品中仅有一批次菌落总数为3～110 CFU/mL，金黄色葡萄球菌为2～6 CFU/mL，其余两批次未检出。而加工时间对微生物影响不显著（p＞0.05），加工时间为5，30和60 min时，加工样品间的微生物指标并无显著差别，但均低于生乳。

表2 超高压加工压力和时间对牛奶中微生物指标的影响

有研究表明，超高压加工的压力在300～500 MPa，随着杀菌压力的升高，杀菌效果逐渐增强[9-11]，而加工压力为100～200 MPa时，杀菌效果并不明显[9]，研究得到相似的研究结果。前人研究中，加工时间对于杀菌效果的影响要小于加工压力，随着加工时间的延长，杀菌效果会有所改善[9-11]，但此次研究中加工时间的效应并未得到证明。就此次研究的试验结果而言，600 MPa加工条件下微生物的存活数量最低，加工时间对微生物指标影响较小，而其他研究表明400 MPa条件下，超过30 min的加工并不会降低牛奶中微生物的数量[10]，因此，考虑到加工时间对杀菌效果可能的改善作用以及生产过程的时间成本，牛奶适宜的超高压杀菌条件是600 MPa维持10～30 min。

2.2 热敏感指标

生乳和加工样品中热敏感指标如表3所示。加工压力对牛奶中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的浓度影响极显著（p＜0.01）。压力为200 MPa时，加工样品两种蛋白含量与生乳相似（p＞0.05）；当压力升至400 MPa时，加工样品中β-乳球蛋白含量显著低于生乳（p＜0.05）；当加工压力为600 MPa时，样品中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白均显著低于生乳和200 MPa加工样品中的含量（p＜0.05）。加工时间会显著影响样品中β-乳球蛋白含量，随着加工时间的延长，β-乳球蛋白浓度显著下降（p＜0.05）；加工60 min后样品β-乳球蛋白的平均含量为加工5 min样品含量的53.5%。α-乳白蛋白含量随加工时间延长仅有下降的趋势（0.05＜p＜0.1）。其他热敏感指标随加工压力和时间的变化均无显著变化（p＞0.05）。

表3 超高压加工压力和时间对牛奶热敏感指标的影响

已有研究证明，α-乳白蛋白和β-乳球蛋白在加工压力分别超过400和100 MPa就发生了变性，并且随着加工时间延长，变性程度会进一步上升[12-13]。在此次研究中，α-乳白蛋白和β-乳球蛋白分别在大于400 MPa和大于200 MPa的压力条件下含量明显降低，并且加工时间延长也会造成两种蛋白含量的降低，这与前人研究结果相一致。β-乳球蛋白对于加工压力和时间的变化比α-乳白蛋白更为敏感，这可能是由于β-乳球蛋白含有自由巯基和更多的二硫键[12-13]，在压力条件下更容易发生变性，并且α-乳白蛋白是一种金属蛋白，与牛奶中钙离子的结合有助于维持其结构稳定性[14]。糠氨酸和乳果糖是牛奶在热加工过程中发生美拉德反应和乳糖异构化的标志性产物[14]，其比乳清蛋白变性更能有效标识牛奶的热加工强度。超高压加工在未加热的状态下并不会引起牛奶的热变化，其产品非酶褐变程度与乳果糖含量和生乳相似[15]，研究中加工样品糠氨酸和乳果糖含量的无显著变化也证明了这一点。乳过氧化物酶活性经常被用于估计巴氏杀菌热加工强度的上限，防止过热加工[16]。牛奶中的多数内源酶都是耐压的，包括乳过氧化物酶[13]。在此次研究中，乳过氧化物酶的活性未受到加工压力和时间的影响。从热敏感指标角度而言，研究600 MPa加工牛奶中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、糠氨酸以及乳果糖的含量与巴杀乳更为接近，优于UHT牛奶[16]。鉴于加工时间的延长会降低α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量，结合超高压的杀菌效果，此次研究优选的加工工艺条件设定为600 MPa维持15 min。

2.3 物理指标

2.3.1 粒径

如图1（A）所示，超高压加工牛奶的粒径分布图和生乳相似，在约0.12 μm和3.0 μm处呈现双峰。与其他样品相比，生乳在0.05～0.25 μm处的颗粒比例较高，在1.2～8.2 μm处的颗粒比例较低，而大于400 MPa加工压力处理的牛奶的颗粒比例呈现相反的趋势。粒径分布的主成分分析结果如图1（B）和1（C）所示。前两个主成分解释了粒径变化94%的变异，其中PC1解释了粒径0.04～0.4 μm减小和粒径1.2～5.2 μm处增大的变化（图1C）。得分图（图1B）显示生乳在PC1的得分为负，而高于400 MPa加工样品的PC1得分为正，而200 MPa维持15 min样品得分居于两者之间，这表明超高压加工压力的增强使得样品中小颗粒比例减少，大颗粒比例增加。

图1 样品粒径分布图

有研究观察到，对于未均质的牛奶粒径分布呈现双峰分布[17]，这与此次研究中粒径分布曲线相似。牛奶中乳脂肪球和酪蛋白胶束的粒径范围分别是1～10 μm和0.01～0.1 μm[18]，因此，试验中0.12和3.0 μm处的双峰可能分别对应酪蛋白胶束和乳脂肪球的粒径分布。600 MPa维持3 min的超高压加工使得生乳的颗粒粒径增大[2]，其粒径分布曲线的变化与此次研究中所得到的结果相一致。当超高压的加工压力超过250 MPa时，脂肪球倾向于集聚形成脂肪球簇，增大颗粒粒径[19-20]。高压加工会促使酪蛋白胶束的解体，酪蛋白颗粒比例减少[21]，而解体的酪蛋白胶束可能会吸附在脂肪球表面，增大脂肪球的粒径颗粒的比例。

2.3.2 色差

与生乳比较，不同加工工艺条件牛奶的参数差值变化如表4所示。随着加工压力的升高，ΔL会逐渐降低。400 MPa维持15 min、600 MPa维持15 min和600 MPa维持30 min的加工样品显著低于生乳。同时高压加工也会促使b升高，600 MPa加工样品的b值显著高于生乳。这表明超高压加工使得牛奶色泽变暗变黄。L值的降低表明参与散射的酪蛋白胶束粒子数减少，伴随着酪蛋白颗粒的解离，200～400 MPa的加工压力促使生乳的L值迅速下降和浊度降低[13]。前人研究中，超高压牛奶与生乳相比，黄色色泽度上升，表现为b值的升高和a值的降低[2,22]，此次研究结果与上述报道相一致，但参数a值无显著变化。

表4 不同处理牛奶与生乳比较的参数差值

3 结论

在此次研究中，超高压加工能够有效降低生乳中的微生物数量，加工压力起主要作用，而加工时间影响并不明显。α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量会随着加工压力的增大而降低，加工时间的延长也会对这两种蛋白的变性造成影响，超高压加工对乳中过氧化物酶以及糠氨酸和乳果糖含量并无影响。通过微生物和热敏感指标的筛选，将600 MPa维持15 min定为此次研究优化的超高压加工条件。通过对加工样品粒径和色泽的对比研究发现，超高压加工会使牛奶中0.05～0.25 μm颗粒比例减少，1.2～8.2 μm颗粒比例增加，并且牛奶色泽变暗变黄。