五碳双缩醛鉴别试验方法的改进

周晓晴，吕小丽，赵淑娟，张文中，郭平，匡佩琳

江西省食品检验检测研究院（南昌 330001）

五碳双缩醛（又名戊二醛），英文名glutaraldehyde，化学式是C5H8O2，为无色或浅黄色的透明液体，有特殊刺激气味，可与水、乙醇以任何比例混合，溶液呈弱酸性。其分子结构式如图1所示。五碳双缩醛被广泛应用于杀菌消毒剂、固定剂、鞣革剂、木材防腐剂、药物和高分子合成原料等[1-2]，在食品行业可作为食品工业用加工助剂，其在GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》中被列作为交联剂，用于胶原蛋白肠衣的加工工艺[3]。

图1 五碳双缩醛结构式

国内外五碳双缩醛的工业化合成主要路线是以丙烯醛和乙烯基醚加成得2-乙氧基-3,4-二氢吡喃，水解得到戊二醛的吡喃法[4-5]。五碳双缩醛作为一种食品添加剂，对五碳双缩醛进行鉴别试验，对规范国内生产和销售具有重要的现实意义。

国家卫生健康委（原卫生部）食品添加剂指定标准《食品添加剂 五碳双缩醛（又名戊二醛）》（2012年第6号）中五碳双缩醛鉴别试验方法为：取20 mL 2,4-二硝基苯肼试剂，加入0.4 mL样品，摇匀，静置5 min，收集沉淀，用乙醇彻底洗涤，用20 mL热二氯乙烯溶解沉淀，过滤。滤液经冰浴冷却至产生结晶，过滤后收集沉淀，用30 mL丙酮回流再溶解，过滤，滤液经冰浴冷却重结晶，过滤，收集沉淀，所得的2,4-二硝基苯腙测定其熔点为185～195 ℃[6]。《美国食品化学品法典》（第十一版）（FCC 11）中五碳双缩醛鉴别试验和美国药典41（USP 41）中浓戊二醛溶液鉴别试验均为熔点测定[7-8]。其试验原理为五碳双缩醛与2,4-二硝基苯肼反应生成2,4-二硝基苯腙沉淀，且2,4-二硝基苯腙具有特定的熔点。

在检验方法研究工作中发现国家卫生健康委（原卫生部）指定标准存在以下2个问题：一是根据标准方法采用二氯乙烯进行溶解上一步生产的沉淀，发现延长溶解时间，提高溶解温度，二氯乙烯都不能溶解沉淀，更不能再下一步生产结晶；二是标准方法中重结晶关键点细节描述不详细，仅说明用30 mL丙酮回流再溶解，过滤，滤液经冰浴冷却重结晶，导致试验重现性差。为此，对五碳双缩醛鉴别试验方法进行分析研究，并对该鉴别方法提出改进意见。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

2,4-二硝基苯肼、硫酸、无水乙醇（均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；二氯乙烷（分析纯，上海麦克林生化科技有限公司）；丙酮（分析纯，西陇科学股份有限公司）；定性滤纸[通用电气生物科技（杭州）有限公司]。

1.2 仪器和设备

QUINTIX124-1CN电子天平（感量0.0001 g，德国赛多利斯公司）；HH-6水浴锅（上海博讯实业有限公司）；Vortex Wizard涡旋混合器（意大利VELP公司）；WRR-Y熔点仪（上海物理光学仪器厂）。

1.3 方法

1.3.1 二氯乙烷重结晶步骤确定

经过重新比对《美国食品化学品法典》（第十一版）（FCC 11）原文发现《食品添加剂 五碳双缩醛（又名戊二醛）》（2012年第6号）方法的溶解试剂可能存在错误，实际应为二氯乙烷。

1.3.1.1 溶解温度确定

《美国食品化学品法典》（第十一版）（FCC 11）原文中只写了热二氯乙烷，而没有标注具体温度。根据二氯乙烷沸点83.5 ℃，同时根据重结晶的原理，在热的溶剂中溶解，冰浴时析出晶体的原理，温度越高，溶解性越好，所以为更多地溶解乙醇洗涤后的沉淀，选择接近沸点的温度80 ℃。

1.3.1.2 溶解方式确定

为保证二氯乙烷和沉淀一直保持在热的状态，溶解过程一直把离心管置于80 ℃水浴中，同时为增大溶液与固体的接触频率，增大溶解度，采用边涡旋边溶解的方式（每隔5 min涡旋1次）。

1.3.2 丙酮回流重结晶步骤确定

1.3.2.1 回流温度确定

《美国食品化学品法典》（第十一版）（FCC 11）原文和《食品添加剂 五碳双缩醛（又名戊二醛）》（2012年第6号）方法中只描述“丙酮回流”，对于回流温度没有描述。根据丙酮的沸点56.5 ℃，选择丙酮回流温度60 ℃。

1.3.2.2 回流时间确定

随着加入的二氯乙烷滤液结晶量的增加，丙酮回流后形成的结晶量也增加，但当加入量达0.15 g以上时增长速度减慢。加入二氯乙烷重结晶沉淀0.15 g左右时，回流2 h，沉淀几乎完全溶解，所以确定回流时间为2 h。

1.3.2.3 丙酮回流时圆底烧瓶内外液面高度确定

在丙酮回流试验过程中发现回流时如果圆底烧瓶内液面的高度低于水浴锅中水（外液面）的高度，会造成圆底烧瓶的粘壁现象，直接导致后续无法形成结晶。内液面高于外液面则不会出现粘壁现象，后续可以形成结晶。

2 结果与分析

建议将《食品添加剂 五碳双缩醛（又名戊二醛）》（2012年第6号）鉴别试验方法修订为：取0.4 mL试样，加入到20 mL 2,4-二硝基苯肼溶液中，摇匀，静置5 min。过滤，用200 mL无水乙醇彻底洗涤，待乙醇自然挥干后收集沉淀于50 mL离心管中，加入20 mL 80 ℃二氯乙烷溶解沉淀，该溶解过程一直保持在80 ℃水浴中，并每隔10 min涡旋1次，溶解1 h后，趁热过滤。滤液经冰浴冷却至产生结晶，过滤后收集沉淀于100 mL圆底烧瓶中。在圆底烧瓶中加入30 mL丙酮，于60 ℃水浴回流2 h再次溶解沉淀，回流时要保证水浴锅的液面低于圆底烧瓶中丙酮的液面，同时每隔一段时间轻微摇晃圆底烧瓶，避免粘壁。回流后，过滤，收集滤液于50 mL比色管中，将比色管置于冰浴中冷却重结晶，过滤，收集沉淀，测定所得结晶的熔点。对优化后的鉴别试验方法进行方法学验证，主要验证其精密度和重复性。

2.1 精密度试验

准确吸取0.4 mL测定用样品，按改进后的方法连续测定6次，计算其标准偏差和相对标准偏差，结果如表1所示。

由表1可知，标准偏差为0.80，相对标准偏差为0.42%，说明试验方法的精密度较高。

表1 精密度的测定结果

2.2 重复性试验

取6份五碳双缩醛样品，按改进后的鉴别试验方法进行测定，结果如表2所示。

表2 重复性的测定结果

从测定结果来看，相对标准偏差为1.10%，其重复性符合试验要求。

2.3 五碳双缩醛鉴别的应用

选取6家公司13个市售五碳双缩醛样品，采用改进后的方法进行鉴别分析，鉴别试验结果如表3所示。

表3 市售五碳双缩醛鉴别结果

从样品测定结果来看，使用优化后的方法步骤，不会出现难结晶的情况，试验重现性好，可有效鉴别五碳双缩醛。

3 结论

试验方法对国家卫生健康委（原卫生部）食品添加剂指定标准《食品添加剂 五碳双缩醛（又名戊二醛）》（2012年第6号）中五碳双缩醛的鉴别试验方法进行改进优化。替换使用二氯乙烷进行重结晶步骤，确定二氯乙烷重结晶步骤中的溶解温度80 ℃，并采用边涡旋边溶解的方式溶解沉淀。优化丙酮回流重结晶步骤，确定丙酮回流温度60 ℃，回流时间2 h，回流时圆底烧瓶内液面应高于外液面。方法学试验和样品测定结果表明，采用优化后的鉴别试验步骤易于操作进行，提高了试验的精密度及重现性，可用于日常五碳双缩醛样品中五碳双缩醛的鉴别测定。