藤葛复合解酒固体饮料的制备及体外解酒作用

李冬梅，杨洁，李宝玉，刘旭光，郝志明，林春华

广东农工商职业技术学院热带农林学院（广州 510507）

酒精滥用是一个世界性的问题，据估计酗酒已成为世界第三大健康问题[1]，长期过量的不合理饮酒可导致包括酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）在内的200多种疾病发生或病情恶化[2]。解酒产品的市场需求越来越大，市场上的解酒产品品种繁多，但口味欠佳、功能性不一[3]。采用药食两用中草药治疗酒精性肝病，不仅避免药物对患者身体的伤害和不良反应，且安全性较高，目前已成为酒精性肝病治疗的新方向[4]。

藤茶Ampelopsis grossedentata（Hand.-Mazz.）W.T.Wang，学名显齿蛇葡萄，是原国家卫计委认定的药食同源药材之一[5]，是我国特有的茶用、药用植物，其主要活性成分是二氢杨梅素[6]。研究表明，二氢杨梅素具有良好的解酒和护肝功能[7-12]，而利用藤茶开发解酒功能食品的报道不多。葛花Puerariae fos，为药食同源植物野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi的干燥花，始载于陶弘景所撰《名医别录》[13]，其主要功能成分为异黄酮类化合物[14]，是传统医学和现代医学中最具代表性的解酒良物之一[15-17]。据不完全统计，关于葛花解酒功效在复方中的运用达21味，现代以葛花为主药开发的醒酒产品达16种[18-19]。这些研究主要以藤茶、葛花原料为基础进行开发，而以其提取物为原料开发的解酒产品甚少，藤茶提取物与葛花提取物联合应用的解酒功能食品研发鲜见报道。

固体饮料因具有携带方便、风味独特、速溶性好等特点，近几年行业发展迅猛[20]。试验以藤茶为原料，提取纯化二氢杨梅素，与葛花提取物复配，通过响应面试验获得感官品质较好的藤葛复合解酒固体饮料，并探讨其体外解酒作用，丰富解酒产品的类型，为解酒功能食品的开发提供新的思路，也为藤茶、葛花的开发利用提供新途径。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

藤茶，江西富牛生态农业发展有限公司；果胶酶（酶活≥30 000 U/g）、纤维素酶（酶活＞400 U/mg），大连美仑生物技术有限公司；葛花提取物异黄酮，西安汇林生物科技有限公司；柠檬酸、甘草酸二钾（甜度为蔗糖150倍）、麦芽糊精，均为食品级，河南万邦实业有限公司；二氢杨梅素（DMY）标准品、氧化型辅酶Ⅰ（NAD+），纯度≥98%，北京索莱宝科技有限公司；乙醇脱氢酶（ADH），酶活≥300 U/mg，美国Sigma公司；海王金樽片，深圳市海王健康科技发展有限公司；RU21解酒药，美国；解酒固体饮料，主要功效物质为酵母提取物、L-阿拉伯糖，市售；解酒固体饮料，主要功效物质为葛根、枳椇子，市售；乙醇、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、焦磷酸钠、明胶、邻苯三酚、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、盐酸等，均为分析纯。

1.2 仪器与设备

电子分析天平，BSA124S，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；真空干燥箱，DZF-6050，上海一恒科学仪器有限公司；超声清洗机，SB-5200DT，宁波新芝生物科技股份有限公司；数显恒温水浴锅，HH-4，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；台式高速离心机，H/T16MM，湖南赫西仪器装备有限公司；pH计，PB-10，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；紫外-可见分光光度计，752，上海奥谱勒仪器有限公司；自动分装机，MAH-101，泉州闽安泓贸易有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 藤葛复合解酒固体饮料制备工艺流程

藤茶→粉碎→酶解→超声辅助提取→抽滤→滤液→结晶→真空干燥→热水复溶→活性炭脱色→结晶（6次）→过滤→真空干燥→二氢杨梅素

二氢杨梅素+葛花提取物异黄酮→加入辅料→混匀→干燥→杀菌→检测→包装→成品

1.3.2 藤葛复合固体饮料制备操作要点

1.3.2.1 藤茶二氢杨梅素的提取纯化

准确称取一定质量过0.250 mm（60目）筛的藤茶粉末，按最佳工艺条件提取：在4%复合酶（W果胶酶∶W纤维素酶=1∶1）、料液比1∶30（g/mL）、pH 3.0、50 ℃下酶解50 min；在超声功率250 W、超声温度50 ℃下提取30 min，趁热过滤出提取液后置于4 ℃冰箱内静置24 h，待析出沉淀物后经过5 000 r/min离心10 min，取沉淀物于60 ℃真空干燥至恒重，得二氢杨梅素粗提物。将二氢杨梅素粗提物用热水复溶，加入活性炭，趁热过滤，将滤液置于4 ℃冰箱内静置24 h，待析出沉淀物后经过5 000 r/min离心10 min，重复结晶6次，真空干燥至恒重，得二氢杨梅素纯化物。经测定，藤茶二氢杨梅素提取率为29.72%，纯度为98.5%。

1.3.2.2 混料

将藤茶提取物二氢杨梅素、葛花异黄酮提取物、柠檬酸、甘草酸二钾、麦芽糊精分别过0.180 mm（80目）筛网，按配方量称量，备用。

1.3.2.3 干燥、灭菌

将原料与各辅料按配方量进行混合，60 ℃下干燥约12 h，至水分≤5%。固体混合料在80 ℃下杀菌5～8 min。

1.3.2.4 检测

对灭菌好的固体饮料用热水进行定量冲调，进行感官评定、体外解酒和抗氧化功能测定。

1.3.2.5 包装

对灭菌好的固体饮料按照预订规格进行定量自动分装、封口。

1.3.3 感官品质评价

参照GB/T29602—2013《固体饮料》感官评价标准，结合产品原辅料本身的感官特性，从色泽、香气、滋味口感、组织形态4个方面进行评价，分别占25%，25%，30%和20%权重，满分100分，组织食品专业背景10人（5男、5女）组成感官评定小组，进行评分，具体见表1。

表1 感官评定表

1.3.4 藤葛复合解酒固体饮料单因素试验

试验开发最小包装为每袋2 g、最佳冲调水量为100 mL、外观口感俱佳的冲调固体饮料，各因素添加量范围以固体饮料粉末质量分数表示。通过查阅相关文献和预试验结果，以感官评分为评价指标，设置DMY添加量分别为10.0%，20.0%，30.0%，40.0%和50.0%，葛花提取物添加量分别为5.0%，7.5%，10.0%，12.5%和15.0%，柠檬酸添加量分别为7.5%，10.0%，12.5%，15.0%和17.5%，甘草酸二钾添加量分别为3.0%，3.5%，4.0%，4.5%和5.0%，以麦芽糊精填充至相应规格，参照1.3.1的工艺流程制成固体饮料，加入90 ℃左右100 mL水搅拌充分溶解后，进行感官评价，确定各因素的最佳用量范围。

1.3.5 藤葛复合解酒固体饮料配方的响应面优化

在单因素试验结果基础上，选取DMY添加量、葛花提取物添加量、柠檬酸添加量和甘草酸二钾的添加量为自变量，以藤葛复合固体饮料的感官评分为响应值，利用Design Expert 8.0.6.1软件进行Box-Behnken中心组合试验设计，设计四因素三水平的响应面试验，确定藤葛复合固体饮料的最佳配比，因素水平设计如表2所示。

表2 配方优化的响应面因素设计及水平 单位：%

1.3.6 藤葛复合固体饮料体外乙醇脱氢酶（ALD）激活作用

采用改良后的瓦勒-霍赫法（Valle & Hoch）[21]进行测定。在带盖的干燥试管中，加入1.5 mL 32 mmol/L的焦磷酸钠缓冲液（pH 8.8），1.0 mL 27 mmol/L氧化型辅酶 I（NAD+）溶液，0.5 mL 11.5%（V/V）乙醇和0.1 mL 1 mg/mL样品溶液（此次研究配方样品1、藤茶提取物以葛花异黄酮提取物代替其余配方相同样品2、葛花异黄酮提取物以DMY代替其余配方相同样品3、市售解酒固体饮料样品4和5），混匀，25 ℃水浴锅中加盖温育5 min后，立即加入0.1 mL ADH（0.25 U/mL）溶液。立即在340 nm波长下测定吸光度，每隔10 s读数1次，直至每分钟吸光度增大值达到稳定为止。乙醇脱氢酶活性计算法以吸光度A对时间作图，计算A340/10 s的增加值，根据NADH在340 nm处的摩尔消光系数6.2，计算酶活力。ADH的活力以每分钟NADH生成的纳摩尔数来表示。空白组用0.1 mL蒸馏水代替样品溶液，以同浓度等体积的海王金樽、RU21作阳性对照，其余操作相同。按式（1）和（2）计算ADH激活率。

式中：E340为340 nm处每分钟平均吸光度增大值；3.2为总反应液的体积，mL；6.2为NADH在340 nm波长下的毫摩尔消光系数；EW为每毫升酶液所含酶的含量，mg/mL。

1.3.7 藤葛复合固体饮料体外超氧阴离子清除作用

参考文献[22]，采用邻苯三酚法，并略作改进。在10 mL比色管中加入4.5 mL Tris-HCl缓冲液（0.1 mol/L，pH 8.2），1 mL 0.025 mg/mL样品溶液（此次研究配方样品1、藤茶提取物以葛花异黄酮提取物代替其余配方相同样品2、葛花异黄酮提取物以DMY代替其余配方相同样品3、市售解酒固体饮料样品4和5）和2.5 mL蒸馏水，混匀，10 min后加入0.1 mL邻苯三酚（6 mmol/L），摇匀后静置3 min，加入0.1 mL的HCl（10 mmol/L）终止反应，以Tris-HCl缓冲液作为参比液，在325 nm下测定溶液的吸光度，记为A1，以等体积的蒸馏水代替样品作空白，测定吸光度，记为A0，以同浓度等体积的海王金樽、RU21作阳性对照，其余操作相同。按式（3）计算清除率。

1.4 数据处理

采取SPSS 25统计软件和Design Expert 8.0.6.1软件分析，每组试验做3个平行，试验数据以平均值表示，多重组间比较采用One Way Anova。p＜0.05为差异有统计学意义，p＜0.01为有显著统计学意义。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 DMY添加量对感官品质的影响

由图1可知，随着DMY添加量增加，感官评分先增加后降低，DMY添加量达到40.0%时，饮料感官评分最高，随着DMY添加量继续增大，感官评分则开始下降。这是由于DMY有独特的苦涩味，添加量过大时，会使饮料的口感偏苦涩，影响饮料的感官评分。因此DMY添加量选择在30%～50%。

图1 DMY添加量对藤葛固体饮料感官评分的影响

2.1.2 葛花提取物添加量对感官品质的影响

由图2可知，随着葛花提取物添加量增加，感官评分先增加后降低，添加量10.0%时，饮料感官评分最高，随着葛花提取物添加量继续增大，感官评分则开始下降。这是由于葛花提取物添加量过大时，会使饮料的色泽偏深，影响饮料的感官评分。因此选择葛花提取物添加量7.5%～12.5%。

图2 葛花提取物添加量对感官评分的影响

2.1.3 柠檬酸添加量对感官品质的影响

由图3可知，随着柠檬酸添加量增加，感官评分先增加后降低，添加量15.0%时，饮料感官评分最高，随着柠檬酸添加量继续增大，感官评分则开始下降。这是由于柠檬酸和甘草酸二钾可以共同中和DMY苦涩味，添加量过大时，饮料口感偏酸，影响饮料的感官评分。因此选择柠檬酸添加量12.5%～17.5%。

图3 柠檬酸添加量对感官评分的影响

2.1.4 甘草酸二钾添加量对感官品质的影响

由图4可知，随着甘草酸二钾添加量增加，感官评分先增加后降低，添加量4.0%时，饮料感官评分最高，随着甘草酸二钾添加量继续增大，感官评分开始下降。这是由于甘草酸二钾添加量过大时，饮料口感甜腻，影响饮料的感官评分。因此选择甘草酸二钾添加量3.5%～4.5%。

图4 甘草酸二钾添加量对感官评分的影响

2.2 响应面试验结果与分析

2.2.1 响应面试验结果

在单因素试验结果的基础上，利用Design Expert 8.0.6.1软件的Box-Behnken中心组合设计原理，以DMY添加量（A）、葛花提取物添加量（B）、柠檬酸添加量（C）和甘草酸二钾添加量（D）为自变量，以饮料感官评分为因变量（Y），进行四因素三水平响应面试验，来确定藤葛复合固体饮料的最佳配方。试验设计方案和结果见表3。

表3 配方优化的响应面试验设计及其结果

2.2.2 模型建立与方差分析

对表3数据进行多元回归拟合分析，得到回归方程：感官评分=88.46-3.01A+0.086B+2.38C-0.067D-0.26AB+0.12AC-2.41AD+1.55BC+2.60BD+1.67CD-10.87A2-6.48B2-4.11C2-6.92D2。试验结果的方差分析见表4。模型p值＜0.000 1，表明该模型显著，失拟项p值为0.074 0＞0.05，不显著，说明该模型可用，与实际情况较吻合。同时，回归方程的相关系数R2=0.967 9，说明该模型能解释96.79%的响应值变化，模型拟合度好，可用该模型对藤葛固体饮料配方进行优化。由F值可以看出，影响藤葛固体饮料配方的主次关系为二氢杨梅素DMY添加量（A）＞柠檬酸添加量（C）＞葛花提取物添加量（B）＞甘草酸二钾添加量（D）。因素的一次项（A）、二次项（A2、B2、C2、D2）的影响极度显著，一次项（C）、交互项（BD）的影响高度显著，交互项（AD）的影响显著，一次项（B、D）、交互项（AB、AC、BC、CD）对结果影响不显著。

表4 配方优化的回归模型方差分析

2.2.3 各因素交互作用响应面分析

藤茶提取物DMY添加量（A）、葛花提取物添加量（B）、柠檬酸添加量（C）、甘草酸二钾添加量（D）4个因素的交互作用对藤葛复合解酒固体饮料感官评分影响的响应曲面见图5～图10。

图5 DMY添加量（A）与葛花提取物添加量（B）的交互作用对藤葛复合解酒固体饮料感官评分的影响

图10 柠檬酸添加量（C）与甘草酸二钾添加量（D）的交互作用对藤葛复合解酒固体饮料感官评分的影响

从图5，图6，图8和图10可以看出，响应面等高线图呈圆形，3D图中曲面的倾斜度较为平坦，表示DMY添加量与葛花提取物添加量的交互项（AB）、DMY添加量与柠檬酸添加量的交互项（AC）、葛花提取物添加量与柠檬酸添加量的交互项（BC）、柠檬酸添加量与甘草酸二钾的交互项（CD）对结果影响不显著。图7和图9中，响应面等高线图呈椭圆形，3D图中曲面的倾斜度均很陡峭，表示DMY添加量与甘草酸二钾添加量的交互项（AD）、葛花提取物添加量与甘草酸二钾添加量的交互项（BD）对结果影响均很显著，与表4中方差分析结果基本吻合。

图6 DMY添加量（A）与柠檬酸添加量（C）的交互作用对藤葛复合解酒固体饮料感官评分的影响

图7 DMY添加量（A）与甘草酸二钾添加量（D）的交互作用对藤葛复合解酒固体饮料感官评分的影响

图8 葛花提取物添加量（B）与柠檬酸添加量（C）的交互作用对藤葛复合解酒固体饮料感官评分的影响

图9 葛花提取物添加量（B）与甘草酸二钾添加量（D）的交互作用对藤葛复合解酒固体饮料感官评分的影响

根据Design Expert 8.0.6.1中“Optimization”功能，得到藤葛复合解酒固体饮料的最优配方：DMY添加量38.55%、葛花提取物添加量10.15%、柠檬酸添加量15.78%、甘草酸二钾添加量4.03%，在此条件下模型预测藤葛复合解酒固体饮料的感官评分为89.05分，考虑到实际操作的可行性，将上述条件调整为DMY添加量38.50%、葛花提取物添加量10.00%、柠檬酸添加量16.00%、甘草酸二钾添加量4.00%。按该配方进行3次平行试验，制备藤葛复合解酒固体饮料，感官评分平均值为89.04分，与预测值接近。

2.3 藤葛复合解酒固体饮料体外解酒、抗氧化功能结果与分析

2.3.1 对乙醇脱氢酶（ALD）激活率的影响

表5表明，藤葛复合固体饮料ADH激活率达到175.38%，远高于市售2款解酒固体饮料，与阳性对照海王金樽和RU21相比，对ADH的激活率略低，但无显著性差异。试验配方对ADH的激活率理论上应比实测值更高，原因是藤茶提取物二氢杨梅素（DMY）在ADH激活率试验反应体系温度（25 ℃）下溶解性降低，容易析出。由此说明藤葛复合固体饮料具有较强的解酒作用，且藤茶提取物DMY与葛花提取物异黄酮复配对ADH激活率有一定协同作用。

表5 藤葛复合解酒固体饮料体外ADH激活率结果

2.3.2 对超氧阴离子清除率的影响

人体摄入高体积分数乙醇时，ADH代谢系统为乙醇的主要代谢途径，同时借助于过氧化氢酶（CAT）系统等进行代谢形成乙醛[23]。过氧化氢酶可催化H2O2生成水和氧，阻止H2O2与细胞有氧代谢中产生的超氧阴离子自由基进一步生成羟自由基，从而防止自由基对细胞的损伤[24]。表6表明，藤葛复合固体饮料对超氧阴离子清除率达62.99%，远高于市售解酒固体饮料，比阳性对照海王金樽和RU21对超氧阴离子清除率均更强，且与RU21之间有显著性差异。由此说明藤葛复合固体饮料具有较强的超氧阴离子清除能力，可通过提高机体CAT活力，起到较好的解酒作用，且藤茶提取物DMY与葛花提取物异黄酮复配对超氧阴离子清除有一定的协同作用。

表6 藤葛复合解酒固体饮料体外超氧阴离子清除结果

3 结论

试验以藤茶为原料，提取纯化活性成分二氢杨梅素（DMY），配以葛花提取物、柠檬酸、甘草酸二钾和麦芽糊精，研制藤葛复合固体饮料，通过单因素试验，研究了DMY添加量、葛花提取物添加量、柠檬酸添加量和甘草酸二钾添加量对复合固体饮料感官品质的影响，确定了各因素的最佳水平。在此基础上，通过响应面试验对配方进行优化，得到藤葛复合固体饮料的最佳配方：DMY添加量38.50%，葛花提取物添加量10.00%，柠檬酸添加量16.00%，甘草酸二钾添加量4.00%，以麦芽糊精充填到2 g/袋规格，溶于100 mL热水中。该配方冲调的固体饮料外观形态、色泽、风味、口感均为最佳，感官评分为89.04分，与模型预测结果89.05分接近。体外解酒作用结果显示，藤葛复合固体饮料浓度1 mg/mL时，其对ADH的激活率达175.38%，远高于市售解酒固体饮料，与同浓度阳性对照海王金樽、RU21相比无显著性差异。体外抗氧化功能结果显示，藤葛复合固体饮料浓度0.025 mg/mL时，其对超氧阴离子的清除率达62.99%，远高于市售解酒固体饮料，比同浓度阳性对照海王金樽和RU21对超氧阴离子清除率均更强，且与RU21之间有显著性差异。该藤葛复合固体饮料富含藤茶二氢杨梅素和葛花异黄酮等活性成分，携带方便、制备工艺简单、口感佳，具有较好的解酒作用，市场前景广阔，值得开发。