海南省万宁市猪流行性腹泻血清学调查分析

黄 芳，张 艳，刘海隆

（1.海南省万宁市动物疫病预防控制中心，海南 万宁 571500；2.海南省农业科学院畜牧兽医研究所，海南 海口 571100）

猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起猪的一种高度接触性肠道传染病，其主要表现为食欲下降、水样腹泻和呕吐，最终导致脱水和高死亡率，各种年龄阶段的猪均易感染，尤其是哺乳仔猪、断奶仔猪和肥育猪，感染发病率高达100%。在20世纪七八十年代，欧洲广泛存在PEDV感染。我国于1980年首次分离到PEDV，之后多地均有PED发生的报道，该病自2010年发生较大变异，全国大部分地区的猪场开始大规模暴发PED，对我国养猪业造成巨大的经济损失[1]。2022年1月，海南万宁市某养猪场出现仔猪腹泻、呕吐、消瘦、脱水等疑似PED病例，患猪体温正常，长时间使用抗生素治疗无效，后期陆续出现死亡现象，肥育猪个别出现水样腹泻，抗生素拌料连续饲喂1周后病情逐渐缓和。笔者上门实地考察，剖检病死猪，发现病理变化主要见于小肠，小肠内充满黄色液体，肠壁变薄，肿胀，肠系膜充血，肠系膜淋巴结肿大。采集病死猪空肠至回肠肠道内容物，送至海南省农业科学院畜牧兽医研究所进行RT-PCR病原检测，最终确诊PEDV感染。为弄清万宁市周边该病病原分布及流行情况，笔者对万宁市中、小规模猪场及部分养殖户进行了血清学调查分析，以揭示PEDV在该地区的流行状况，有助于该市对PED的预防和控制做出正确决策。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品来源 2022年1—3月，在万宁市下辖13个镇区及兴隆华侨农场养殖户及养殖场采取现场调查、填写问卷的形式，分不同周龄、不同品种的猪采集血液样本468份，逐一编号，室温下自然凝固10～20 min，离心10 min左右（3 000 r/min）分离血清，每份血清不少于2 mL，置于-20 ℃冰箱备检。

1.1.2 试剂 猪流行性腹泻病毒检测试剂盒，江苏依莱萨生物技术有限公司生产。

1.2 试验方法

按照试剂盒说明书，待检样品用样品稀释液做40倍稀释，阴性对照、阳性对照不稀释。浓缩洗涤液恢复室温且完全溶解后用蒸馏水做20倍稀释为工作洗涤液。试剂盒在使用前平衡30 min至室温。取所需用量酶标板条，设空白对照1孔、阴性/阳性对照各2孔。空白对照孔加样品稀释液100 μL，阴性、阳性对照孔分别加入阴性、阳性对照液100 μL，样品孔每孔加入稀释后的样品100 μL。混匀，盖好盖板膜，37 ℃水浴避光反应30 min。甩去孔内液体，每孔加350 μL工作洗涤液，静置30 s后弃去，重复洗涤5次，最后一次拍干。每孔加酶标记物100 μL，空白孔除外。盖好盖板膜，置37 ℃水浴避光反应30 min。重复洗涤5次。每孔依次加底物液A、底物液B各50 μL，混匀，盖好盖板膜，37 ℃水浴避光反应10 min。每孔加终止液50 μL，于450 nm测定各孔吸光值。

测定结果判定，阳性对照孔平均OD值≥0.6；阴性对照孔平均OD值必须≤0.3；阈值（SP）计算：SP值=（样品孔OD值-阴性对照孔OD值）/（阳性对照孔OD值-阴性对照孔OD值），SP值≥0.2，结果判定为阳性；SP值＜0.2，结果判定为阴性。

2 结果

在参与调查的26个养猪场，未接种过猪流行性腹泻相关疫苗及生物制品，4个猪场在样品收集期间仔猪出现持续腹泻的情况；其他22个养猪场在采集血样期间均未出现腹泻症状。

由表1可见，从万宁各乡镇采集的样品PEDV抗体总阳性率为39.10%，场阳性率为50%。北部乡镇（包括三更罗镇、北大镇、龙滚镇、山根镇、和乐镇、后安镇、大茂镇）阳性率为41.48%，南部乡镇及农场（包括礼纪镇、长丰镇、万城镇、南桥镇、东澳镇、兴隆华侨农场）阳性率为35.86%，北部地区稍高于南部地区。收集的血清样品分为3个日龄组：5周龄、10周龄和15周龄左右，PEDV抗体血清阳性率分别为46.15% 、44.23%、26.92%。外来猪种与地方猪种PEDV抗体血清阳性率分别为36.27%和44.44% ，场阳性率分别为41.18%和66.66%。

表1 PEDV抗体检测结果

3 分析与讨论

海南万宁市共有13个镇（区），每个镇（区）均有传统的分散饲养、户营为主的养殖模式养猪，散养户主要以陆川猪、定安黑猪、屯昌黑猪为主，规模场以大白、长白猪为主。本次对未接种PEDV疫苗的养猪场进行了PEDV感染的血清学调查，样品总体阳性率为39.10%，50%养殖场的PEDV抗体血清阳性属于自然感染。5周龄、10周龄和15周龄左右的猪血清阳性率依次递减，北部地区高于南部地区，地方猪明显高于外来猪种，这可能与当地天气、猪场饲养管理水平差异有关。本次调查还发现并不是所有的阳性感染猪场出现临床症状，说明存在极大的持续隐性感染风险。本次采用ELISA（酶联免疫吸附试验）检测PEDV抗体，具有成本效益高、简单、快速、准确的特点，还可以同时对已经接种商业PEDV疫苗的猪场做出免疫效果评价。

通过免疫接种PEDV、TGEV（传染性胃肠炎病毒）和PRoV（轮状病毒）二联疫苗或三联疫苗来预防猪病毒性腹泻疾病，可以取得一定的效果[2]。本次调查发现常规接种上述疫苗的养殖场并不多，已经接种PED疫苗的养殖场反映仍有仔猪腹泻情况的发生，可能与PED流行毒株不同有关，提醒当地兽医主管部门及养殖场要制定合理的疾病监测方案和防控策略。