室内袋式和管道式光生物反应器对湛江等鞭金藻生长及生化组分的比较分析

吕布 陈煜 李曦 李娇妮 臧战 石耀华 VASQUEZ Hebert Ely,2 郑兴,2 顾志峰,2

(1 海南大学海洋学院，海南海口 570228；2 海南大学南海海洋资源利用国家重点实验室，海南海口 570228)

海洋微藻营养组成丰富，可以有效地将无机营养物质、水、二氧化碳和其他物质转化为有机化合物，如碳水化合物、蛋白质和脂质[1-2]。湛江等鞭金藻(Isochrysiszhanjiangensis)是一种海洋金黄色鞭毛微藻[3]，是分布于我国南方湛江湾地区的海洋浮游单细胞藻类，具有生长快速、营养丰富、不含纤维素细胞壁、富含多不饱和脂肪酸等特点。该藻可应用于不同的饲料工业和海水养殖系统，如在对虾和双壳类幼体养殖中作为优质饵料等。该藻可在室内和室外广泛养殖并大量生产，具有大规模培养的潜力。目前有关湛江等鞭金藻的研究在多不饱和脂肪酸和多糖方面较多，对其蛋白质方面的研究较少[4-5]。该藻的最适生长温度为25 ℃[6]，然而我国南方地区夏季藻类培养池的水温经常高达35 ℃以上[7]，严重阻碍了其生长和繁殖，从而提高了生产成本和养殖风险[8]。

微藻的高密度培养主要分为管道式、平板式、柱式和浮式薄膜袋式等[9-11]。近年来我国微藻产业发展迅速，养殖基地遍布全国，但养殖基地大多采用玻璃钢桶、跑道式水泥池等设施养殖微藻，这些设施构造简单、成本低廉、操作方便，但占地面积大，易发生污染问题[12]。有学者利用聚乙烯薄膜袋培养微藻，显著降低了生产成本。聚乙烯薄膜袋具有采光面积较大、保温性能稳定、不易被污染、操作方便等优点，但薄膜袋易破损漏水，难以实现规模化培养[13-14]。管道式光生物反应器是近年来微藻户外培养时常用的一种培养装置，具有光照表面积大、结构可调节性强等特点，被广泛应用于微藻生产，可提高微藻生产率和光合效率[11,15-16]，其可靠性、有效性和低成本等优点日益引起人们的重视，具有较好的应用前景。

本研究通过比较在管道式光生物反应器与传统聚乙烯袋式培养环境中湛江等鞭金藻的生长、叶绿素含量和有机物含量变化等情况，从藻密度、色素含量和有机物含量的角度综合评价这2种模式的培养效果，以期为采用管道式光生物反应器开展室内微藻培养提供科学依据，并探索湛江等鞭金藻细胞室内大规模培养的可行性。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验用湛江等鞭金藻来自海南大学海洋学院微藻保种室。试验前将藻种进行纯化扩培，取快速生长期的藻液开展室内培养试验。

试验用培养液为课题组基于“宁波3#”微藻培养液优化所得。具体配方为：化肥尿素50 mg、NaH2PO410 mg、FeSO42.5 mg、MnSO40.25 mg、EDTA-2Na 10 mg、VB16×10-3mg、VB120.5×10-6mg、过滤海水1 L。

试验用水为经过沙井过滤、沉淀、漂白水消毒后的自然海水。

室内培养过程中的温度、光照强度、光周期等理化条件为人工控制条件。

1.2 试验设计

试验于2020年12月—2021年1月在海南省文昌市进行。根据培养模式分为2个试验组，即管道式光生物反应器组和聚乙烯袋组，每组设3个平行。管道式光生物反应器的供气系统由泵、输气管、调节阀组成，工作体积约为1 000 L；聚乙烯袋的工作体积约40 L(见图1)。试验充气量在单位体积内统一控制在20 L/min，接种细胞密度约为10.0×104cells/mL。试验水温维持在(25±1) ℃，光照强度控制在5 500 lx，光暗周期比为12 h∶12 h(光照∶黑暗)，试验持续16 d。

将处于指数生长期的湛江等鞭金藻用培养基调整到相同数量级(104cells/mL)，经离心(3 500 r/min，10 min)后分别接种至1 000 L的管道式光生物反应器和40 L的聚乙烯袋中。

各试验组接入藻种并混匀后，每隔24 h进行取样。将样品依次通过Whatman GF/C过滤膜进行抽滤，获得藻细胞。将收集好的滤膜分别放入离心管中冷冻保存，将藻液留在取样瓶中，于4 ℃条件下保存。

(a)管道式光生物反应器；(b)聚乙烯袋

1.3 检测指标和方法

1.3.1 藻细胞数目测定

采用血球计数板法进行测定。

1.3.2 藻细胞干质量测定

预先称量烘干Whatman GF/C过滤膜，将一定体积的藻液在该膜上过滤，经过冲洗去除营养盐，放到105 ℃烘箱中烘干72 h以上后称量，直至前后两次质量差不超过2 mg，然后计算烘干后微藻+滤膜与滤膜两者质量的差值，即为藻细胞的干质量[17]。

1.3.3 胞内生物质测定

叶绿素含量：利用丙酮萃取法提取微藻体内的叶绿素。取待测藻液样品20 mL，抽滤至Whatman GF/C膜上，随后用镊子将膜取下，置于50 mL离心管底部，加入10 mL的90 %丙酮溶液，立即放入4 ℃冰箱中避光保存1～3 d，在黑暗、低温条件下进行萃取。萃取后，在4 ℃、4 000 r/min条件下离心10 min。将离心后的提取液上清液小心注入1 cm比色皿中。以90%丙酮溶液作参比，用分光光度计(岛津UV-1700)分别测定在波长630、647、664 nm处溶液的吸光度值。计算减去波长750 nm下测得的吸光度值，得到校正后的E664、E647、E630值。按照以下 方程式计算叶绿素a(Cchla，mg/L)、叶绿素b(Cchlb，mg/L)和总叶绿素(Ctchl，mg/L)的质量浓度[18]。

Cchla=(11.85E664-1.54E647-0.08E630)×10/V

(1)

Cchlb=(21.03E647-5.43E664-2.66E630)×10/V

(2)

Ctchl=(20.21E647+8.02E664)×10/V

(3)

式(1)～(3)中，Cchla、Cchlb、Ctchl分别为叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素的质量浓度(mg/L)，E630、E647、E664分别为在波长630、647、664 nm处溶液的吸光度值，V为试验用藻液体积(mL)。

总蛋白质含量：称取0.1～0.3 g被测样品，包于特制锡箔中，并置于自动落样器上。样品在燃烧反应炉(960 ℃)、通氧量170 mL/min条件下充分燃烧300 s，直至氧剩余量为12%时停止燃烧。燃烧反应炉中的试剂依次为280 g氧化铜(CuO)、13 g银(Ag)丝、15 g铂(Pb)。燃烧炉中的产物放入TC检测器(Rapid N Ⅲ，Elementar公司)检测[19]。

可溶性糖含量：称取0.1 g被测样品，按照待测样本质量(g)∶蒸馏水(mL)=1∶10的比例加入蒸馏水，沸水浴加热60 min。之后取出离心管，再加30 mg活性炭，混匀，放置30 min，过滤，加3 mL无水乙醇，再用蒸馏水定容至15 mL。取1 mL提取液于刻度离心管内，加5 mL蒽酮试剂，拧上盖子，沸水浴10 min后，将离心管冰水浴或用自来水冲洗冷却至室温停止反应。停止反应后20 min，用紫外分光光度计测得630 nm处的吸光度值，另外用标准葡萄糖溶液以相同的反应条件和检测方法做标准曲线。比对标准曲线，计算样品的可溶性糖含量[20]。

1.4 数据处理与统计

生产力Px[g/(L·d)]和比生长速率μ(d-1)通过下述公式计算[21]。

Px=(Cm-Ci)/tc

(4)

μ=(lnCm-lnCi)/tc

(5)

式(4)～(5)中，Ci为初始生物量质量浓度(g/L)，Cm为最大生物量质量浓度(g/L)，tc为与最大生物量浓度有关的培养时间(d)。

试验数据以“平均值±标准差”的方式表示。采用EXCEL 2016和DPS 14.5软件进行数据处理和统计分析。采用单因素方差分析法进行差异性显著分析，设P<0.05为差异显著。

2 结果

2.1 两种养殖模式下湛江等鞭金藻生产力和比生长速率的差异

由表1可见，管道式光生物反应器养殖模式下湛江等鞭金藻的生产力和比生长速率显著优于聚乙烯袋培养模式(P<0.05)。

表1 两种养殖模式下湛江等鞭金藻生产力和比生长速率的差异

2.2 两种养殖模式下湛江等鞭金藻生长密度的差异

在两种养殖模式下，湛江等鞭金藻的生长整体均呈先缓慢增长后快速增长，随后呈稳定状态，最后开始降低的趋势，但管道式光生物反应器模式的变化趋势更加明显(见图2)。

在管道式光生物反应器模式下，湛江等鞭金藻从第4天开始进入快速生长期，其细胞密度为(0.72±0.09)×106cells/mL，并在第7天细胞密度达到峰值，为(1.97±0.14)×106cells/mL，之后开始进入平稳期。在聚乙烯袋模式下，湛江等鞭金藻生长趋势相对平缓，于第9天达到峰值，其细胞密度为(0.99 ± 0.02)×106cells/mL，显著低于管道式光生物反应器模式下的峰值(P<0.05)。

注：不同大写字母代表相同养殖模式下不同养殖时长之间存在显著性差异，不同小写字母代表相同养殖时长不同养殖模式之间存在显著性差异(P<0.05)，下同。

2.3 两种养殖模式下湛江等鞭金藻叶绿素a、b和总叶绿素含量的差异

两种养殖模式下，湛江等鞭金藻叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素质量浓度整体都呈先缓慢增长后快速增长，随后呈稳定态势，最后开始降低的趋势，且管道式光生物反应器模式下的变化趋势更明显(见图3～5)。

图3 两种养殖模式下湛江等鞭金藻叶绿素a的差异

图4 两种养殖模式下湛江等鞭金藻叶绿素b的差异

图5 两种养殖模式下湛江等鞭金藻总叶绿素的差异

管道式光生物反应器模式下，叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素质量浓度在第4天开始进入快速增长期，并在第7天达到峰值(分别为0.46、0.44、0.92 mg/L)后进入平稳期。聚乙烯袋模式下，叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的增长趋势相对平缓，三者质量浓度的峰值显著低于管道式光生物反应器模式下的(P<0.05)。聚乙烯袋组在养殖第9天，叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的质量浓度分别达到峰值0.26、0.26、0.52 mg/L。

2.4 两种养殖模式下湛江等鞭金藻有机物含量对比

在管道式光生物反应器培养模式下，湛江等鞭金藻有机物的质量浓度比在聚乙烯袋培养模式下的要高，且二者间有机物含量存在显著性差异(P<0.05)(见表2)。管道式光生物反应器模式下，湛江等鞭金藻有机物的最大生物量(干质量)、最高总蛋白质质量浓度和最大可溶性糖质量浓度分别达(0.160 1±0.004 0)g/L、(107.267 7±9.632 8)mg/L、(9.587 8±0.868 1)mg/L，均显著高于聚乙烯袋模式(P<0.05)。湛江等鞭金藻单细胞胞内有机物的含量两种模式之间没有显著性差异(P>0.05)(见表3)。

表2 两种培养模式下湛江等鞭金藻有机物含量比较

表3 两种培养模式下湛江等鞭金藻单细胞胞内有机物含量比较

3 讨论

3.1 两种养殖模式下湛江等鞭金藻的生长及差异

微藻的大规模培养已成为微藻产业化中公认的难点和热点。光生物反应器作为生产高附加值微藻产品的技术平台，其中的管道式光生物反应器由于发展快、应用广泛而极具代表性。但在反应器的设计方面，各种微藻的最佳培养条件和最低成本消耗仍需不断地进行探索。藻种、外界环境和培养方式等是微藻培养过程中常见的影响因素[22]。其中光照是光生物反应器最主要的影响因子，影响微藻生长的主要因素还有温度、pH等[23]。刘青等[24]使用锥形瓶在光照培养箱中培养湛江等鞭金藻，试验设置了5个光照强度梯度，发现该藻生长的最适光照强度为5 000 lx，在此光照条件下，其生长速率最大可达0.188个/d，叶绿素质量浓度最高为282.64 μg/L。本试验接种的是同一藻种，采用LED灯作为光源，光照强度为5 500 lx，在室内温度为(25±1)℃的条件下，在管道式光生物反应器中培养，湛江等鞭金藻最大藻密度、比生长率和叶绿素质量浓度分别为1.97×106cells/mL、0.396 7/d和0.92 mg/L，明显优于聚乙烯袋式培养模式和刘青等[24]的试验结果。这可能是由于管道式光生物反应器管径较小，玻璃材质的管壁透光性好，光照均一性好，显著提高了光照效率[25]，从而促进了微藻的快速生长，提高了培养密度，缩短了培养周期。

3.2 两种养殖模式下湛江等鞭金藻叶绿素及有机物含量的差异

不同培养模式会影响藻细胞的叶绿素含量。在管道式光生物反应器模式和聚乙烯袋模式下，分别在7 d和9 d内，湛江等鞭金藻的叶绿素含量均随着藻细胞生长而增加，并在第7天和第9天分别达到最高值(0.92、0.52 mg/L)。单位水体叶绿素含量的变化反映了藻类密度或生物量的变化。当藻类生长速率较高时，生物量一般也较高，二者的变化趋势相近[24]。本试验的结果也表明，在相同的光照强度和周期下，湛江等鞭金藻的叶绿素含量与其比生长速率成正比，比生长速率越快，叶绿素含量越高。

本研究发现，在试验周期内，管道式光生物反应器、聚乙烯袋中湛江等鞭金藻有机物的质量浓度并不一致。在管道式光生物反应器模式下，湛江等鞭金藻生物量(干质量)和可溶性糖含量显著高于聚乙烯袋养殖模式。在管道式光生物反应器模式下，湛江等鞭金藻的总蛋白质含量显著高于聚乙烯袋模式，主要原因是聚乙烯袋模式培养的藻生物量过低，导致最后蛋白质产量也较低。与董学卫等[26]使用平板式半连续培养的湛江等鞭金藻相比，本试验管道式光生物反应器模式下湛江等鞭金藻的蛋白质含量较高，而可溶性糖含量要低于前者试验多糖的含量。本试验结果表明，养殖模式对湛江等鞭金藻生物量、蛋白质和可溶性糖含量的影响程度不同。其中，管道式光生物反应器对湛江等鞭金藻生长的促进作用最为显著。随着科学技术的发展和生产的实际需求，更好的管道式光生物反应器模式将会被开发并应用于微藻规模化培养，微藻养殖有望成为水产养殖业新的经济致富点。

4 结论

管道式光生物反应器可以提高光照效率，有利于湛江等鞭金藻的生长，缩短其培养时间，并且适用于微藻的高密度培养。同时，管道式光生物反应器可以解决湛江等鞭金藻生产周期长及产量不足的问题，为其进一步的规模化应用奠定了基础。