椰子油对海南黑山羊羔羊瘤胃氢代谢、甲烷生成及相关酶活性的影响

2022-06-13施力光吴灵丽侯冠彧周汉林

中国畜牧杂志 2022年6期

施力光，张雨，吴灵丽，刘强，侯冠彧，周汉林*

（1.中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，海南儋州 571737；2.山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801）

我国是世界上碳排放量较多的国家之一，随着联合国大会“碳中和”目标的提出，二氧化碳（CO）、甲烷（CH）等温室气体（GreenHouse Gas GHG）的减排受到越来越多的关注。据统计，在畜牧养殖领域由反刍动物通过瘤胃发酵以嗳气和反刍等方式产生的CH约占到人类活动GHG 排放总量的五分之一，如能通过营养调控技术降低反刍动物CH排放及饲料营养物质损耗，无论在环境保护还是提高饲料利用率和动物生产性能等方面都具有积极意义。长期以来，大量研究聚焦于改变日粮中饲料品质或精粗料配比或直接在日粮中添加特异性化合物、生物制剂以调控反刍动物瘤胃甲烷的生成，添加油脂已成为较为通行的甲烷减排方法。Zhang 等在山羊日粮中添加玉米油，改善了瘤胃发酵特征并抑制了甲烷的生成；Judy 等在奶牛日粮中添加约2%的玉米油能降低奶牛瘤胃甲烷的生成；Patra等发现，椰子油可能通过改变瘤胃微生物区系，进而降低甲烷产生；Panyakaew 等在瘤胃体外产气试验中，推测富含中长链饱和脂肪酸的油脂参与生物氢化过程从而降低甲烷产生。目前油脂调控反刍动物瘤胃甲烷产生的机制说法仍不一致，且瘤胃发酵中间氢代谢的情况还鲜有报道，尤其在幼龄反刍家畜甲烷生成及氢代谢特征还未见研究。且前期研究发现，添加适量椰子油能提高初生羔羊生长性能。本试验采用富含大量中短链饱和脂肪酸植物油脂的椰子油作为瘤胃发酵调控剂，重点探索椰子油对羔羊瘤胃发酵过程氧化还原态和中间氢代谢的影响，以期为营养调控反刍动物甲烷的生成提供试验数据和科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计及日粮选用24 只（公母各半）10 日龄、平均体重（2.05±0.16）kg 海南黑山羊羔羊（中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所海南黑山羊种羊场），随机分成4 组，每组6 个重复。对照组饲喂基础日粮，试验组分别添加4、6、8 g/d 椰子油（海南品椰品实业有限公司）。试验羊日粮组成为代乳粉+精料+鲜王草，日粮组成成分及营养成分见表1。代乳粉（北京精准动物营养研究中心，表2）经温水溶解后饲喂量为羔羊体重的2%，椰子油通过一次性注射器直接饲喂到羔羊口中，精料（种羊场自配）和鲜王草（表2）则按照50:50（干物质基础）提供给羔羊自由采食，自由饮水。每日（07:00、17:00）饲喂2 次，试验期为60 d。

表1 精料原料组成及营养成分（干物质基础）

表2 代乳粉及王草营养成分（干物质基础）

1.2 样品采集和分析

1.2.1 瘤胃液的采集各组羔羊于试验期第58、59 天晨饲后2 h，使用瘤胃液采样器收集瘤胃内容物，4 层纱布过滤收集瘤胃液，分置于15 mL 离心管内，现场测定pH 和氧化还原电位（pH 测定仪/氧化还原电位检测仪，上海仪电雷磁PXSJ-216），剩余样品-20℃保存待测其他指标。

1.2.2 微生物蛋白（MCP）参照熊文秀等测定方法进行部分改进，将瘤胃液超声破碎15 min（功率400 W，超声3 s，间隔5 s，工作40 次，重复2 次）后，按照总蛋白（TP）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）推荐的步骤采用考马斯亮蓝法测定MCP 浓度。

1.2.3 瘤胃液溶解H（dH）、溶解CH（dCH）等测定参照Wang 等使用的方法，先将不同个体固定体积的瘤胃液体外充N培养，气相色谱法测定气态H、CH，再根据体外发酵产气量进行测算。

1.2.4 瘤胃液氧化还原态指标的测定烟酰胺腺嘌呤二核苷酸/还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+/NADH）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸/还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+/NADPH）含量按照检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）提供的酸性碱性提取液分别提取瘤胃液中NAD+和NADH、NADP+/和NADPH，通过噻唑兰（MTT）还原法，在570 nm 比色测定。NADH 氧化酶（NOX）活性测定按照试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）推荐方法将瘤胃液中NADH氧化为NAD，通过2,6 二氯酚靛蓝（DCPIP）显色，在570 nm 比色测定。

1.2.5 瘤胃液氢代谢相关酶活测定乳酸脱氢酶（LDH）测定按照试剂盒（南京建成生物工程研究所）推荐方法将瘤胃液中乳酸催化为丙酮酸，碱性条件下显色，在440 nm 比色测定。苹果酸脱氢酶（MDH）测定采用试剂盒（南京建成生物工程研究所）按单位时间瘤胃液中MDH 的氧化还原活性速率通过340 nm 比色测定。琥珀酸脱氢酶（SDH）测定按照试剂盒（南京建成生物工程研究所）推荐方法，将瘤胃液中黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）还原成还原型黄素腺嘌呤二核苷酸（FADH2），通过DCPIP 显色，在600 nm 比色测定。PDH 测定采用试剂盒（南京建成生物工程研究所）通过催化瘤胃液丙酮酸脱氢，DCPIP 显色，在605 nm 比色测定。AADH测定按照ELISA 试剂盒（南京建成生物工程研究所）推荐的方法，通过HRP 标记的羟酯酰辅酶A 抗原抗体复合物经底物与TMB 显色后，在450 nm 比色测定样品与底物的颜色变化进行酶活性换算。

1.3 统计分析数据经过Excel 整理，采用SPSS 18.0软件进行单因素方差分析，进行Duncan's 多重比较，试验结果以平均值± 标准差表示，<0.05 为差异显著性判断标准。

2 结果

2.1 椰子油对羔羊瘤胃pH 和MCP 的影响由表3 可知，在羔羊日粮中添加椰子油后，会改变瘤胃pH，其中添加4 g/d 和8 g/d 椰子油可提高瘤胃pH（<0.05）；添加椰子油不会对羔羊瘤胃发酵MCP 的浓度产生影响（>0.05）。随着椰子油使用量的增加，羔羊瘤胃液中dH和dCH浓度下降（<0.05）。

表3 椰子油对羔羊瘤胃发酵和H2、CH4 代谢含量影响

2.2 椰子油对羔羊瘤胃氧化还原态的影响如表4 所示，添加椰子油对羔羊瘤胃液中NAD+影响不显著，对羔羊瘤胃液中NOX 活性也无显著影响。NADH 浓度随椰子油添加量增多呈上升趋势，且6、8 g/d 椰子油NADH 浓度与对照组和4 g/d 差异显著。添加椰子油对羔羊瘤胃液中NADP+和NADPH 浓度影响显著，NADPH 随着椰子油添加量增加而上升（<0.05），6 g/d 椰子油组NADP+浓度较对照组增加约20%。经检测，与对照组相比，瘤胃液氧化还原电位的变化随着椰子油使用量的增加呈现出升高趋势（>0.05）。

表4 椰子油对羔羊瘤胃氧化还原态参数的影响

2.3 椰子油对羔羊瘤胃氢代谢酶活性的影响由表5 可见，6、8 g/d 椰子油组羔羊瘤胃液LDH 活性高于对照和4 g/d 椰子油组（<0.05）。与对照组相比，8 g/d椰子油组羔羊瘤胃液中PDH 活性为2.21 U/mL（<0.05），添加椰子油可增强羔羊瘤胃液中SDH 活性（<0.05），MDH 和AADH 活性未受椰子油添加影响（>0.05）。

表5 椰子油对羔羊瘤胃氢代谢酶活性的影响

3 讨论

3.1 椰子油对羔羊瘤胃发酵特性的影响反刍动物瘤胃微生物的发酵受瘤胃内温度、pH 和日粮组成等因素影响。瘤胃pH 作为评价瘤胃内环境稳态的第一指标，直接影响瘤胃内微生物组成及发酵特性。在水牛和山羊体外瘤胃发酵中分别添加亚油酸和亚麻籽油可显著降低发酵液pH，而在绵羊和肉牛体外瘤胃发酵葵花籽油或苏子油对瘤胃pH 和挥发性脂肪酸（VFA）无显著影响。结合本研究前期在体内外发酵模式下VFA 含量的变化趋势，推测可能是由于随着椰子油添加剂量的增加，造成瘤胃发酵乙酸比例降低，相对降低了乙酸丙酸比值，使羔羊瘤胃发酵向丙酸发酵模式转变，一定程度上提高了瘤胃pH。

本试验中不同处理组间瘤胃MCP 未受到椰子油的添加产生显著变化。Shang 等、Vargas 等研究也表明，在奶牛日粮中、在体外模拟发酵试验中分别使用大豆油、葵花籽油和鱼油对MCP 无显著影响。其原因是通过粗蛋白质形式体现的瘤胃细菌和原虫等菌体蛋白，其含量由细菌和原虫的数量决定，基本保持稳定，除非在微生物结构或多样性发生剧烈变化时MCP 才会出现改变。

反刍动物瘤胃微生物（主要是产甲烷菌）会通过氢营养途径利用氢生产CH，对饲料的利用效率和环境都造成了不利影响。前期研究发现椰子油对甲烷的产生有显著的抑制效果。本试验主要关注瘤胃液中dH和dCH，其中dH不仅有影响瘤胃发酵VFA 的生物活性，还是瘤胃中甲烷形成的前体，添加椰子油后能够显著降低羔羊瘤胃液中dH，导致发酵途径产生的H较少，从而降低乙酸浓度，提高了丙酸浓度。Wang 等在奶牛模型试验中证明，dH与dCH呈正相关（相关系数>0.58）。本研究中所测瘤胃发酵dCH也随着椰子油添加量提高呈降低趋势，尤其是6、8 g/d 椰子油均可显著降低dCH，也解释了前期体外试验CH降低、瘤胃发酵特征变化的原因。

3.2 椰子油对羔羊瘤胃氧化还原态参数的影响氧化还原电位（势）作为反映瘤胃内被氧化的分子和被还原的分子的比例的参数，与瘤胃pH 均能直观判断瘤胃发酵机能，在瘤胃发酵过程中随着厌氧微生物发酵，瘤胃内生长环境需要保持较低的氧化还原电势。本试验中羔羊瘤胃液中氧化还原电位在-285～-315 mV，随着椰子油添加量增多呈升高趋势，表明瘤胃的发酵特性受到影响。郑超等在体外模拟发酵试验中，增加通气量会造成氧化还原电位的显著提高；陈伟在不同消化底物的体外试验中也检测到了氧化还原电位的改变；Dijkstra 等报道，氧化还原电位与pH 呈负相关，与乳酸浓度呈显著正相关。

NAD+/NADH 和NADP+/NADPH 作为机体每一种活细胞中都存在的两对辅酶，在氧化还原态稳定的维持过程中发挥着重要的生物学功能。在瘤胃微生物发酵过程中，氧化还原反应是大多数微生物产生能量的关键生化过程，NAD+能够结合1 个H和2 个e转换为还原态的NADH。通过影响氢离子供体或者NAD 前体，均能够改变体外发酵培养液氧化还原状态，而电子受体对瘤胃氧化还原状态影响的相关研究还鲜有报道。本试验中，添加椰子油改变了羔羊瘤胃液pH 和发酵特征，NADH 浓度则随椰子油添加量增加呈显著升高，但未检测到NAD+浓度显著变化，推测可能是因为椰子油中大量的中链饱和脂肪酸的代谢不是经过丙酮酸的氧化脱羧直接代谢造成的。已有研究证实，厌氧微生物细胞发酵的途径中单糖能被瘤胃微生物发酵产生丙酮酸，进而通过发酵乙酸产生乳酸这一途径补充所需的NAD+；而NADH 则不能直接被氧化，只能通过NADH 脱氢酶的作用进行脱氢变成NAD+。van Lingen 等在肉牛瘤胃气体、溶解代谢产物和菌群分析中发现，氢气分压增加会抑制NADH 氧化，这也可能是添加椰子油组羔羊瘤胃NADH 有显著差异的原因。NADH 转化为NAD另一个重要途径是NADH 氧化酶NOX 的催化作用。陈伟研究发现，添加烟酸能提高培养液中NADH 浓度，NOX 酶活性也增加。本试验中，每日添加6 g 以上的椰子油可显著增加NADH 浓度，而对NOX 活性没有影响，推测可能是因为NOX 催化NADH 具有明显的底物偏好性，型的NADH 作为NOX 最适底物，会受到乳酸菌浓度的影响。

NADP+/NADPH 作为另一对氧化还原过程脱氢酶的辅酶，同样是重要的递氢体。Lewis 等研究发现，在氧化还原反应体系中，还原的NADPH 比氧化的NADP+丰富10 倍，而NAD+/NADH 氧化还原对主要用于生物氧化，因此它在活细胞中的稳态平衡有利于氧化的NAD+而不是NADH。NADPH 不能从细胞外来源获得，而必须通过每个细胞内NADP+的减少来产生。本试验中，添加椰子油可显著增加瘤胃液NADPH 浓度，一方面因为NADP+浓度随着椰子油添加量增加而升高后，NADPH 还原性加强导致NADPH 浓度随着椰子油添加剂量增加而显著增加；另一方面NADH 可以通过糖酵解途径利用NADP+和中间氢和2 个电子完成转化，这也是本试验中NAPH 和NADP+变化趋势一致的原因。

3.3 椰子油对羔羊瘤胃发酵中间氢代谢的影响瘤胃内产甲烷菌主要通过氢的氧化生成甲烷，其他瘤胃微生物也是通过高效的氢传递来降低瘤胃内氢分压（包括gH和dH）进而保障自身发酵功能的维持。乳酸、苹果酸、丙酮酸等有机酸作为瘤胃发酵产物，在各自对应的脱氢酶作用下，实现分解和生成的平衡。丙酮酸可以通过LDH 催化生成乳酸，在此过程中需NADH 提供的H作为供体。Liu 等在热应激条件下，肉牛饲料中添加丙酮酸盐后显著增加了瘤胃LDH 活性和氧化还原酶活性；Rutherford 等研究表明，远距离运输后屠宰肉牛的瘤胃LDH 活性极显著增加；杨艳研究分析认为，牛瘤胃发酵过程中高比值的NADH/NAD+使LDH活性大幅升高。本试验结果也表明，添加6、8 g/d 椰子油后，NADH/NAD+比值高于对照组（约为3.7），LDH 活性也增加了50%以上，表明椰子油可影响瘤胃乳酸发酵途径的氢传递过程。潘晓花等研究发现，在高精料奶牛饲养时添加硫胺素和羟基硫胺素能显著增加体外发酵试验PDH 活性。本试验中，添加高剂量的椰子油后PDH 有显著升高，结合前期瘤胃发酵试验数据，瘤胃正常的发酵机能受到影响，产生了类似于高精料导致酸中毒的丙酮酸氧化脱羧反应加强，添加椰子油可提高PDH 活性而减少丙酮酸的积累。MDH 是另一个能以NAD+和NADP+为底物进行氢传递的酶。Maeda等报道，牛发生瘤胃酸中毒反应后，血浆LDH 和MDH 活性与应激反应呈正相关。本试验中，MDH 活性未受到添加椰子油的影响，推测可能是因为NADP依赖型的MDH 通过CH-OH 基团形式进行氢传递的。

在调控瘤胃甲烷生成过程中，Tomkins 等研究发现，硝基化合物竞争结合氢生成氨，在体外发酵试验中降低甲烷的排放量达90% 以上；Latham 等研究发现，使用硝酸盐和某些短链硝基化合物可抑制SDH活性。本试验检测到SDH 活性随着椰子油添加量的增加而显著升高，是因为在反刍动物日粮中添加硝酸盐通常会增加乙酸和乙酸盐以及丙酸盐浓度，椰子油也能造成乙酸丙酸浓度的显著改变，可以考虑在添加椰子油的基础上添加一定剂量硝基化合物，作为阻断氢生成甲烷的新思路。