姜黄素对断奶仔猪肠道屏障、抗氧化和线粒体功能的影响

2022-06-13洪奇华徐求文金妙仁胡彩虹

中国畜牧杂志 2022年6期

洪奇华，李鑫，徐求文，金妙仁，胡彩虹*

（1.浙江大学动物科学学院，浙江杭州 310058；2.杭州百瑞特饲料科技有限公司，浙江杭州 311200）

由于仔猪肠道结构和功能尚未发育完善，早期断奶会引起仔猪生理、营养和环境条件的突然变化，从而导致断奶综合征，给养猪业带来巨大损失。肠上皮是机体抵御有害抗原和病原体的关键屏障，而线粒体呼吸链酶复合体参与呼吸链的电子传递和ATP 生成，对肠上皮细胞更新和正常生理功能具有重要作用。研究表明，断奶会破坏内环境平衡，导致肠道发生氧化应激、屏障功能损伤以及线粒体功能紊乱。如何缓解仔猪断奶氧化应激、促进仔猪健康成长，已成为学术界和产业界共同关注的焦点。

姜黄素是一种从姜科或天南星科植物根茎中提取的酚类色素，属于天然抗氧化剂，具有保护肠黏膜、抗氧化、调节代谢、抑菌抗炎等功能。袁欢等报道，姜黄素可以提高畜禽生产性能、产品品质，并增强机体的免疫力。芦娜等研究表明，日粮中添加姜黄素可提高断奶仔猪生产性能和养分表观消化率。姜黄素因其抗氧化应激功能而受到广泛关注，但能否缓解由氧化应激引起的肠道损伤和线粒体损伤尚不清楚。本文旨在研究姜黄素对断奶仔猪肠道屏障、抗氧化和线粒体功能的影响，为缓解仔猪断奶应激提供新的营养调控技术和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计选取28 日龄体重约7.5 kg 的断奶杜大长仔猪60 头，按胎次、体重相近和公母各半分成2 组，每组3 个重复，每个重复10 头。对照组饲喂基础饲粮（表1），基础日粮参照美国NRC（2012）仔猪营养需要推荐量配制。试验组饲喂基础饲粮+200 mg/kg 姜黄素（根据实验室前期对断奶仔猪生长性能影响的研究选取适宜添加量，未发表）。试验期14 d，试验结束称重后，从每个重复选取2 头接近平均体重的仔猪进行屠宰取样。试验期间自由采食和饮水，仔猪的免疫按常规免疫程序进行，饲养管理措施严格执行卫生防疫制度。

表1 试验基础日粮组成及营养水平

1.2 生长性能测定试验期间，每天观察并记录仔猪采食和健康情况。试验开始和结束时空腹称重，以每个重复为单位记录耗料量，计算平均日增重、日平均采食量和耗料增重比。

1.3 肠道样品取样肠道组织样品：仔猪屠宰后取十二指肠、空肠和回肠中段各4 cm，用生理盐水将其轻轻冲洗干净，浸入10% 福尔马林溶液中，置于4℃冰箱保存，待做组织切片。仔猪屠宰后取2 段长度为8 cm左右的空肠组织（相邻于肠道形态样品部位），用PBS 漂洗去除肠道内容物后立即用于尤斯灌流（Ussing Chamber）实验。

肠黏膜样品：仔猪屠宰后取约8 cm 长的近端空肠组织，用生理盐水漂洗去除肠道内容物后，用滤纸吸干水分，再用手术刀钝端刮取空肠黏膜，迅速用液氮冷冻后转移至-80℃冰箱保存。

1.4 小肠黏膜结构测定十二指肠、空肠和回肠组织固定、脱水、包蜡、切片、HE 染色后，显微镜拍照，测量绒毛高度和隐窝深度。绒毛高度为绒毛顶端至隐窝开口处的垂直距离，隐窝深度则为隐窝开口至隐窝基部的垂直距离。

1.5 肠屏障功能根据Cao 等和徐露蓉等方法，采用尤斯灌流技术检测肠上皮细胞跨膜电阻（Transepit helial Electrical Resistance，TER）和肠上皮对荧光素异硫氰酸酯-葡聚糖（4 kDa-FITC dextran，FD4）的通透性。

1.6 肠道氧化还原状态空肠黏膜超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione Peroxidase，GSH-Px）活性，总抗氧化能力（Total Antioxidant Capacity，T-AOC）和丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量用酶联免疫（Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA）试剂盒检测。上述指标的测定均使用南京建成生物工程研究所的试剂盒，具体操作根据试剂盒说明书进行。

1.7 肠黏膜线粒体的提取与肠黏膜线粒体呼吸链复合物I-IV 活性测定将约0.5 g 空肠黏膜组织置于预冷的MSH 缓冲液中均质，匀浆后在4℃下以1 000×g 离心10 min。MSH 缓冲液：10 mmol/L pH 7.5 的HEPES，200 mmol/L 甘露醇，70 mmol/L 蔗糖，1.0 mmol/L EGTA和2.0 mg/mL 血清白蛋白。然后将收集到的上清液在4℃以3 500×g 离心后放置10 min（线粒体膜对温度高度敏感，所以整个操作必须在冰上进行，用到的溶液和离心管都必须预冷，否则线粒体容易破裂），获得线粒体沉淀，进一步用BCA 法检测蛋白浓度。

利用线粒体呼吸链复合物活性定量测定试剂盒测定线粒体复合物I（NADHCoQ 还原酶），II（琥珀酸辅酶Q 还原酶），III（CoQ-细胞色素C 还原酶）和IV（细胞色素C 氧化酶）的活性，上述指标的测定均使用上海杰美基因医药科技有限公司的试剂盒，具体操作根据试剂盒所附说明书进行。

1.8 统计分析采用SPSS 10.0 对数据进行单因素方差分析。试验数据以平均值± 标准差表示。<0.05 表示差异显著，>0.05 表示差异不显著。

2 试验结果

2.1 姜黄素对断奶仔猪生长性能的影响由表2 可见，与对照组相比，试验组的平均日增重提高6.10%（<0.05），耗料增重比降低4.35%（>0.05）。

表2 姜黄素对断奶仔猪生长性能的影响

2.2 姜黄素对断奶仔猪肠黏膜形态的影响由表3 可见，姜黄素能显著改善断奶仔猪黏膜形态。与对照组相比，试验组十二指肠、空肠和回肠的绒毛高度分别提高了9.16%、10.70% 和10.94%（<0.05），十二指肠、空肠和回肠隐窝深度分别降低了11.56%（<0.05）、2.84%（>0.05）和6.60%（>0.05），十二指肠、空肠以及回肠的绒毛高度/隐窝深度分别提高了23.03%、13.70%和19.00%（<0.05）。

表3 姜黄素对断奶仔猪黏膜形态的影响 μm

2.3 姜黄素对断奶仔猪空肠TER、FD4 的影响表4 显示，相对于对照组，试验组仔猪空肠中的TER 提高了11.65%（<0.05），而FD4 通透性降低30.24%（<0.05），说明日粮中添加姜黄素能明显改善断奶仔猪的肠道屏障功能。

表4 姜黄素对断奶仔猪空肠TER、FD4 的影响

2.4 姜黄素对断奶仔猪空肠黏膜中抗氧化酶活性和MDA 含量的影响与对照组相比，试验组空肠黏膜中SOD、GSH-Px 和T-AOC 活性分别提高了12.65%、16.31%和18.58%（<0.05），MDA 含量降低了20.00%（<0.05），可见日粮中添加姜黄素可以显著改善断奶仔猪的抗氧化功能。

2.5 姜黄素对断奶仔猪肠空肠黏膜线粒体呼吸链复合物I-IV 活性的影响由表6 可知，与对照组相比，试验组的空肠黏膜线粒体呼吸链复合物I-IV 活性分别提高了40.95%、29.90%、34.38% 和21.28%（<0.05），表明姜黄素能明显提高断奶仔猪空肠黏膜的线粒体功能。

表5 姜黄素对断奶仔猪空肠黏膜中抗氧化酶活性和MDA 含量的影响

表6 姜黄素对断奶仔猪肠空肠黏膜线粒体呼吸链复合物I-IV 活性的影响 μmol/（min·mg）

3 讨论

3.1 姜黄素对仔猪生长性能的影响仔猪早期断奶会出现生长滞缓现象，原因之一是断奶造成的氧化应激。寻找有效的抗应激剂，让仔猪平稳度过此重要生理阶段，已成为动物营养学家的一个重要课题。姜黄素具有抗氧化能力，可用作抗应激剂来提高畜禽生产性能。有研究显示，姜黄素能提高畜禽的生长性能、产品品质、养分表观消化率、机体免疫力。本研究结果表明，姜黄素能缓解仔猪断奶应激引起的生长性能下降，显著提高断奶仔猪日增重，同时降低耗料增重比，可以作为缓解仔猪断奶应激的营养调控剂。

3.2 姜黄素对仔猪小肠黏膜形态的影响肠黏膜结构和形态完整是保证机体营养物质正常消化吸收、仔猪健康成长的基础。体内外应激会使肠黏膜结构遭到破坏，小肠绒毛萎缩和隐窝加深，造成仔猪生长阻碍。本研究结果显示，日粮添加姜黄素能显著提高断奶仔猪十二指肠、空肠和回肠绒毛高度，降低十二指肠、空肠和回肠隐窝深度，说明姜黄素能明显改善肠形态指标，保障机体营养物质消化吸收，从而提高仔猪生产性能。

3.3 姜黄素对断奶仔猪空肠TER、FD4 的影响在正常情况下，机体自由基维持在相对稳定的动态平衡中。在应激状态下，机体抗氧化防御系统发生紊乱，导致自由基累积，造成肠屏障功能损伤并降低动物的生产性能。体内外研究表明，应激可引起肠上皮屏障完整性受损，导致营养物质代谢功能障碍。TER 的降低和FD4通透性的升高常用来表征肠屏障受损。本研究结果显示，断奶仔猪饲料中添加姜黄素，能增加肠上皮细胞跨膜电阻，同时降低了物质通透性，表明其对保护肠道屏障功能、保持肠黏膜结构完整具有积极作用。

3.4 姜黄素对断奶仔猪空肠粘膜中抗氧化酶活性和MDA含量的影响小肠是对氧化应激最敏感的器官之一。研究发现，断奶应激导致仔猪血清中活性氧和MDA 含量增加，而SOD 和GSH-Px 等抗氧化酶活性显著降低。然而饲喂姜黄素能显著提高蛋鸡血清和组织样品的CAT、SOD、T-AOC 和GSH-Px 活性，并降低MDA 含量。本研究中，断奶仔猪日粮中添加姜黄素后，空肠黏膜中SOD、T-AOC 和GSH-Px 活性显著提高，而MDA 含量则显著降低，进一步表明姜黄素能拮抗氧化应激，维持肠道正常生理功能，提高生长性能。

3.5 姜黄素对断奶仔猪肠道线粒体功能的影响线粒体功能损伤可能是仔猪肠道功能紊乱的重要原因。线粒体的电子呼吸链由I、II、III、IV 4 个膜蛋白复合物组成，其活性下降可使呼吸链的电子传递受阻，影响ATP 生成，同时还可使电子从呼吸链中泄露后直接与氧分子作用，产生大量氧自由基，进一步引起线粒体和组织细胞功能障碍，因此线粒体呼吸链复合物的活性可作为衡量线粒体功能的指标。研究表明，肠炎患者或细胞氧化应激可降低胞内线粒体复合物活性下降，导致线粒体能量代谢障碍。本研究结果显示，日粮中添加姜黄素能明显提高断奶仔猪肠内线粒体呼吸链复合物I、II、III、IV 的活性，从而缓解氧化应激引起的能量生成紊乱和肠屏障完整性受损，提高生长性能，说明维持线粒体的正常功能也是姜黄素抗氧化应激的一个重要途径。