羊精浆生化指标与精子质量常规参数相关性分析

2022-06-13李春艳孙智鹏王诗佳陈亚乐张子军

中国畜牧杂志 2022年6期

张彦，李春艳，孙智鹏，王诗佳，陈亚乐，孟祝，张子军

（安徽农业大学动物科技学院，安徽合肥 230036）

正常精液约含5% 精子（以及伴随细胞）和95%精浆。精浆作为精液非细胞液体部分，主要由精囊腺（贡献65% 的精浆）以及睾丸、附睾、前列腺、尿道球囊腺和尿道周围腺和输精管壶腹部的分泌物形成，精浆富含蛋白质、糖类、脂质、无机离子（如Ca、Mg、K、Zn、Na）以及小分子代谢物等，保障精子存活、运动和受精。精浆也可通过修饰排卵前卵泡内分泌-免疫-细胞因子网络，缩短LH 峰值和排卵时间点之间的间隔，促进排卵，促进子宫-输卵管连接处以及子宫中与精子运输和保护相关基因的表达变化。精液成分评估常被用于表征与雄性不育相关的精子质量和病理状态，如精浆Fe过量或不足会导致精子形成缺陷和男性生育障碍。精浆酶如-谷酰基转移酶（GGT）、肌酸激酶（CK）和碱性磷酸酶（ALP）参与精子成熟过程中的各种代谢。GGT 主要通过降低氧化应激来保护精子，CK 通过肌酸和磷酸肌酸之间化学转换催化ATP再生；在病理状态下如感染、炎症或精索静脉曲张，精浆酶浓度变化，引起氧化应激，影响膜流动性、渗透性，从而对精液成分和精子功能产生不利影响。精液尤其是精浆成分和性质存在物种、品种和个体差异。研究显示，不同品种的公猪精浆酶活（ALP、GGT、CK 以及乳酸脱氢酶LDH）和Ca浓度有显著差异。基于此，本研究检测绵、山羊精浆14 项常规生化指标和精子质量常规参数，分析羊精浆生化指标与精子质量常规参数之间的关联性，为羊精液质量评价及繁殖潜力评估与监测提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 样本来源及采集处理试验羊来自安徽省皇竹牧业科技有限公司种羊场，以放牧为主、补饲为辅，平均年龄2～3 岁，健康状况良好，性欲旺盛。通过人工假阴道法分别采集13 只山羊精液和10 只绵羊精液。

1.2 精子质量参数测定精液液化后借助江淮分水岭综合试验站实验室的精子质量辅助分析仪（CASA，SCAV-P-01 E200，西班牙Hamilton Thorne 公司）进行精子质量常规参数分析，并按照WHO 标准分析精子数、浓度、活力、曲线速率（VCL）、直线速率（VSL）、平均速率（VAP）、线性指数（LIN）、直线指数（STR）和摆动指数（WOB）。

1.3 精浆生化指标测定精液样本采用高速离心机（Xiangzhi TGL16M，长沙湘智离心机仪器有限公司）在4 ℃下4 000 r/min 离心10～15 min，取上清液，存于-80℃冰箱，用于检测各项生化指标。利用全自动生化分析仪（Mindray BS-180VET，深圳迈瑞医疗国际有限公司）检测羊精浆生化指标。丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLB）、白蛋白/球蛋白（A/G）、肌酐（CREA-S）、钙（Ca）、磷（P）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）和果糖胺（FUN）检测试剂盒均为深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司（Mindray）产品。

1.4 统计统计数据采用Excel 整理，利用IBM SPSS Statistics 26.0 软件进行统计分析。羊精子质量常规参数和相应的精浆生化指标值均以平均值±标准误表示，使用经典相关性分析，<0.05 表示相关性显著，<0.01表示相关性极显著。

2 结果

2.1 羊精子质量常规参数检测表1 结果显示，羊精子平均浓度达1 205.02×10/mL 及以上，平均活力在78%以上，山羊精子运动速率、运动指数与绵羊相似，其中直线速率达26.00 mm/s 以上。

表1 羊精子质量常规参数检测结果

2.2 羊精浆生化指标检测表2 结果显示，山羊精浆蛋白质含量丰富，TP 为56.72 g/L，其中GLB 占76%以上，ALB 占TP 不到24%；此外，精浆含多种酶如ALT、AST、LDH 和CK，其中LDH 和CK 活性较高，分别为962.01 U/L 和 1 880.02 U/L，以及其他成分如TC、TG 和丰富的FUN。绵羊精浆TP 达28.04 g/L，其中GLB 含量占78%以上，ALB 占比不到22%；精浆也含ALT、AST、LDH 和CK 等多种酶，其中LDH 和CK活性较高，分别为1 957.30 U/L 和944.35 U/L；此外，精浆中还包含Ca、P 等微量元素以及TC、TG 和FUN等其他成分。

表2 羊精浆14 项生化指标结果

另外，山羊与绵羊精浆生化指标差异性比较结果显示，山羊精浆TP、GLB、ALB、FUN、CK、CREA-S（<0.01）以及TC（<0.05）高于绵羊，而绵羊精浆LDH、TG、Ca、P 和ALT 高于山羊（<0.01）；精浆A/G 和AST 值无显著差异。

2.3 山羊精浆生化指标与精子质量常规参数相关性表3 结果显示，山羊精浆TP 与精子数呈正相关、与精子浓度和活力呈负相关。其中，ALB、A/G 与精子数呈负相关，与精子活力呈极显著负相关，与VCL 呈显著负相关，与精子浓度呈正相关；GLB 和精子数、浓度、活力、运动速率的相关性趋势则与ALB 或A/G 相反。精浆Ca和精子数、浓度、活力、运动速率的相关性趋势与P 的亦相反。FUN 与精子活力及运动速率呈正相关，FUN与VCL 或VAP 相关性显著（<0.05）。精浆中不同酶与精子质量常规参数相关性各异。

表3 山羊精浆生化指标与精子质量参数相关性

2.4 绵羊精浆生化指标与精子质量常规参数相关性表4 结果显示，绵羊精浆TP 和ALB 与精子数量、浓度和活力呈正相关，与精子运动速率呈负相关，GLB 则与精子运动速率呈正相关。精浆Ca 和精子运动速率相关性趋势与P 的相反。FUN 或LDH 与精子活力呈正相关。精浆酶ALT 与精子VCL 呈正相关（<0.05），AST 与LIN 呈正相关（<0.05）；CREA-S 则与各项精子质量常规参数均呈负相关。

表4 绵羊精浆生化指标与精子质量参数相关性

3 讨论

睾丸中生成的精子虽然形态完整，但其必须经历附睾成熟过程才能获得活力和受精能力。精子活力是精子功能的基本参数之一，对雄性生育力至关重要。低振幅对称尾部运动表明精子具活力，驱使精子在非黏性介质（精浆）中沿直线运动；精子进入输卵管后，高振幅和不对称鞭毛弯曲即超激活运动使精子克服黏稠液体，脱离输卵管上皮和穿透卵母细胞透明带。精子运动的动力来源主要依靠其中段线粒体氧化磷酸化以及轴丝动力蛋白ATP 酶转化ATP 供能。此外，微环境pH、特殊分子、离子浓度等变化也会刺激精子超激活运动。本实验借助CASA 系统并按WHO 标准分析羊精子活力，发现绵、山羊鲜精的活力均达78% 以上，符合羊鲜精活力基本要求。

哺乳动物精浆作为精子载体，其包含一系列蛋白/酶和非酶成分，表征精子代谢和功能。附睾管分泌蛋白质、连同磷脂质一起包被于精子表面，形成脂蛋白膜以保护精子；附睾体分泌前动蛋白以促进精子直线运动，雄激素依赖蛋白则使精子获得与透明带结合能力，附睾上皮分泌蛋白有助于吸收来自睾丸精子悬浮液中水分和电解质，从而提高精子浓度等。近期研究表明，精浆蛋白质如膜结合G 蛋白偶联受体影响附睾精子成熟过程，精浆G 蛋白偶联受体水平与精子总数、精子浓度、活力以及精子形态等常规质量参数呈现正相关。精浆超氧化物歧化酶（SOD）亚型如锰超氧化物歧化酶（MnSOD）、铜锌超氧化物歧化酶（CuZnSOD）与精子活力呈正相关，MnSOD 表达与精子数呈正相关；相反，精浆谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）表达与精子形态和活力呈负相关。本研究表明，绵羊精浆TP 与精子数、精子活力呈正相关；山羊精浆TP 与精子数呈正相关，而与精子活力呈负相关。精子形成受协同和部分重叠机制调控，涉及睾丸内睾酮、FSH 及LH。FSH影响支持细胞分化，睾丸FSH 诱导支持细胞分泌抗凋亡存活因子和黏附分子，这大部分分泌物进入管腔室（Adluminal Space），促进精细胞存活及成熟。Collodel 等对不同家畜（马、猪）的精浆生化成分分析，结果显示ALP 和LDH 为精子存活、运动以及生育提供能量，GGT、CK 和ALP 与精子质量和精膜功能相关：GGT 通过应对氧化应激保护附睾精子运动，CK催化磷酸肌酸和促进ATP 再生，ALP 能防止精子过早获能。FUN 是葡萄糖和蛋白质赖氨酸残基-氨基之间非酶反应的稳定产物，血清FUN 主要反映血糖水平，可维持渗透压及减少氧化损伤，也间接反映血脂状况；精浆FUN 涉及精子获能、顶体反应和配子互作，浓度降低引起雄性不育。精浆FUN 浓度通常比血清中低2～3 倍，正常人精浆FUN 浓度范围为0.15～0.75 mmol/L，牛精浆FUN 浓度达0.77 mmol/L，而本实验检测到绵、山羊精浆FUN 分别为0.21、0.32 mmol/L，提示精浆FUN 浓度具有物种差异性。此外，精浆含有许多蛋白质，这些蛋白质似乎对精子生存和功能提供适宜微环境很重要。ALB 作为一种重要的非酶蛋白，通过其多重结合位点和自由基捕获特性发挥作用。人体组织间隙液中ALB 浓度范围为7.00～30.00 mg/mL，血浆中ALB浓度为34.00～54.00 mg/mL，而精液中ALB 浓度仅为1.00 mg/mL。ALB 被认为是运输激素、代谢物和药物，是一种循环抗氧化剂，中性粒（白）细胞及精子中ALB 直接结合hHv1 来激活离子通道，增强H外流和促进获能；精浆ALB 主要由支持细胞产生，其与生精状态、精子数、形态正常精子百分比及精子浓度呈正相关。本试验结果表明，绵、山羊精浆ALB 浓度分别达5.92、13.23 g/L，其与精子浓度及WOB 呈正相关，而猪精子WOB 比值随获能时间依赖性增大。这些结果提示动物精浆ALB 对精子产生和获能具有重要的间接作用。

精浆微量元素对精子正常功能必不可少。研究表明，精浆含Ca、Mg、Zn、K 和Na 等多种微量元素。Ca 主要通过诱导顶体反应参与受精过程，同时刺激睾丸间质细胞类固醇生成。细胞Ca 通过调节ATP 可用率来调节精子获能和超活化，胞内Ca水平过高引起顶体胞吐和生育力下降。相关性研究表明，马精浆Ca 水平为1.78～6.27 mmol/L，与精液量、pH 及精子浓度呈正相关；精子正常和其活力异常的男性精浆Ca水平分别达0.29、0.17 mmol/L，二者差异水平显著，精浆Ca水平下降可引起精子活力下降；然而也有研究发现精子正常和其活力异常的精浆Ca 水平无显著差异，其范围在4.95～6.12 mmol/L，且与精子质量不相关。绵羊、山羊精浆Ca 水平分别达2.54、1.61 mmol/L，差异显著，与精子活力及运动速率呈负相关；山羊精浆Ca 与精子数量及浓度呈正相关。P 在雄性动物繁殖方面具有多种有益作用，其磷酸盐离子形式对前列腺酸性磷酸酶活性至关重要，与精液液化过程及腺苷酸环化酶相关，是精子活力的初级调控者。绵羊精浆P 水平大致为5.85 mmol/L，山羊为3.64 mmol/L；都与精子数呈负相关，与精子运动速率呈正相关。而正常男性精液P水平达466.26 mmol/L，病变精液（畸形精子症）中P水平显著下降，且与凋亡标记Caspases 呈正相关，提示精浆P 水平的物种差异及其对维持精子正常形态的重要性。