藏猪和大约克夏猪RBP5 基因多态性及表达差异性分析

肖青青，何辰庆，徐士军，陈军军，段梦琪，张 健，商 鹏*

（1.西藏农牧学院动物科学学院，西藏林芝 860000；2.西藏特色农牧资源研发省部共建协同创新中心，西藏林芝 860000）

猪脂肪沉积既影响猪胴体品质也影响肉质风味。脂肪组织作为能量储存和内分泌器官，对机体能量稳态起着重要作用，是动物体内重要的组成部分，其分化与发育是一个复杂的过程，受多基因调控，脂肪的积累是由脂肪沉积和脂肪代谢之间的平衡关系所决定，同时，脂肪的含量与猪胴体品质、猪肉风味、嫩度、多汁性密切相关。目前，已鉴定出与猪脂肪代谢相关的基因有：生长激素（）、C1q 肿瘤坏死因子相关蛋白（）、脂联素、瘦素、核受体亚家族4 A组成员3（）、载脂蛋白A1（）以及细胞分裂周期42（）等。

视黄醇结合蛋白（）是疏水小分子结合蛋白家族的一员，主要由肝脏合成，在维生素A 生理功能发挥时起着重要作用；同时，在胞内协助视黄醇的转运。而视黄醇结合蛋白5（）是视黄醇结合蛋白家族新的成员，主要分布于肝脏中，在视黄醇代谢中扮演着重要角色，其分子结构由10 条反向平行的链组成。Bahar 等研究证实基因在脂肪和肝脏组织中有一定的表达。

大约克夏猪经过长期选择形成了生长速度快、胴体性能好以及沉脂能力低等特点；藏猪是我国少有的高原小型地方品种猪，具有耐粗饲、耐寒、抗低氧以及沉脂能力强等特点。本实验选取西藏林芝地区的藏猪和大约克夏猪为研究对象，利用实时荧光定量PCR 技术，探究基因在肝脏、肾脏以及腹脂中的相对表达量，通过单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）分析对基因3'侧翼区、5' 侧翼区和CDS 区进行SNPs 位点筛选，以期为研究猪基因调控脂肪代谢的分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 本实验以藏猪（TP）和大约克夏猪（YY）为研究对象，藏猪来源于西藏农牧学院实习牧场，大约克夏猪来源于林芝市宇高生态农业开发有限公司。采集藏猪（50 头）和大约克夏猪（48 头）耳组织，置于75%酒精中，-20℃保存，用于提取总DNA。选择相同饲养方式且健康状况良好的180 日龄藏猪和大约克夏猪（各8 头）进行屠宰，分别采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背脂、腹脂、腿肌和背最长肌各2 份样品，立即放入RNA 保存液中，液氮速冻，再放置于-80℃保存，用于总RNA 提取。

1.2 主要试剂与仪器 RNA 保存液（购自北京百泰克生物技术有限公司）、2×Taq PCR Mix、FastKing（With gDNase）快速反转录试剂盒、SYBR Green 定量PCR试剂盒（购自北京天根生化科技有限公司）、PCR 扩增仪（购自北京奥秘佳得医药科技有限公司）、罗氏定量仪（购自上海土森视觉科技有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 DNA、RNA 提取及cDNA 的制备 采用苯酚-氯仿法提取耳组织中的总DNA，Trizol 法提取各组织中的总RNA，RNase-Free ddHO 溶解，1% 琼脂糖凝胶电泳法和Nano Drop 2000 超微量分光光度计检测DNA（浓度范围为900～1 000 ng/µL）、RNA 浓度（浓度范围为1 200～1 400 ng/µL）和质量，DNA 于-20℃保存备用，RNA 于-80℃低温冰箱保存备用。cDNA 的制备根据FastKing（With gDNase）快速反转录试剂盒说明书进行。

1.3.2 定量引物与DNA 引物设计与合成 从NCBI 网站上下载已经公布的猪（Sus scrofa）基因的mRNA序列（登录号：NM-00145223），使用Premier 5.0 软件设计荧光定量PCR 扩增产物（表1），以（登录号：XM_0031225183）、（登录号：AY550069）基因为内参基因，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，RNase-Free ddHO 进行溶解，-20℃保存。

表1 定量PCR 引物序列

登录GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank），下载基因（登录号：NC_010447）DNA 序列。使用Premier 5.0 软件设计、NCBI 网页在线设计基因3'侧翼区、5'侧翼区和CDS 区的特异性引物（表2 为部分引物序列），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，RNase-Free ddHO 溶解，-20℃保存。

表2 筛选SNPs 的引物序列

1.3.3 半定量及荧光定量PCR 采用所反转的9 个组织cDNA 进行半定量，其程序为：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸20 s，40 个循环；72℃延伸5 min，4℃保存。PCR 产物用1% 琼脂糖凝胶电泳检测，分析RBP5、基因在猪不同组织中的表达情况。

采用SYBR Green 定量PCR 试剂盒在实时荧光定量PCR 仪进行扩增。根据半定量结果，选择表达量较高组织的cDNA 样品进行定量PCR，每个样品设3个重复并设置标准样和空白样，反应体系为20 µL：Mix 10 µL，RNase-Free ddHO 8 µL，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 µL，cDNA 模板（浓度范围为1 200～13 000 ng/µL）为1 µL；荧光定量程序为：95℃预变性15 min，95℃变性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸30 s，共35 个循环。样品目的基因的表达量采用2法计算：

ΔC=C-C

ΔC=C-C

ΔΔC=ΔC-ΔC

目的基因表达量=2

1.3.4 普通PCR 扩增 以提取的DNA 为模板进行普通PCR 扩增。PCR 扩增体系为20 µL：2×PCR HeroMix（dye）10 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，RNase-free ddHO 8 μL，DNA 模板1 μL。

PCR 反应程序：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸50 s，共36 个循环；72℃延伸5 min；4℃保存。将PCR 产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，合格产物送至成都生物工程股份有限公司进行测序。

1.3.5 基因型频率与基因频率 以提取的藏猪和大约克夏猪DNA 为模板，采用混池测序进行基因多态性分析，藏猪和大约克夏猪各10 头，用Chromas Pro软件进行序列对比分析，筛选SNPs 位点后，针对有效筛选出的位点扩大样本进行单个个体测序，由成都生物工程股份有限公司进行测序。根据测序结果统计基因频率和基因型频率。

1.3.6 统计分析 对个体测序结果使用Excel 软件计算各突变位点的基因频率和基因型频率，使用SigmaPlot 10 制备图表，使用SPSS 22.0 软件对基因型分布和基因型频率进行检验，结果以“平均数±标准误”表示，<0.01 表示差异极显著，<0.05 表示差异显著。

2 结果与分析

2.1基因半定量结果与不同组织中的相对表达量由图1、图2 可知，、基因在不同组织中表达有差异，基因中，肾脏表达量最高，其次为肝脏、脾脏和腹脂，在肺脏和背脂中的表达相对较低。

图1 RBP5 基因在不同组织中的表达情况

图2 内参β-actin 在不同组织中的表达情况

使用荧光定量PCR 技术检测藏猪和大约克夏猪肝脏、肾脏和腹脂中基因的表达水平，结果显示：在肝脏、肾脏和腹脂这3 个组织中，藏猪和大约克夏猪的基因表达量趋势一致，均为肾脏中的表达量最高，其次为肝脏，腹脂中的表达量最低；在肾脏和肝脏中，藏猪的表达量极显著低于大约克夏猪，在腹脂中，藏猪的表达量显著低于大约克夏猪（图3）。

图3 RBP5 基因在腹脂、肝脏、肾脏中mRNA 相对表达量

2.2 普通PCR 扩增结果 普通PCR 扩增结果用1% 琼脂糖凝胶电泳检测，扩增的PCR 条带清晰明亮，条带长度约为899 bp，与预期目的条带大小一致（图4），另2 对引物经混池测序，无突变位点。

图4 RBP5 基因目的片段扩增凝胶电泳结果

2.3基因型频率与等位基因频率分布分析 利用ChromasPro 软件对个体测序结果和原序列对比（图5），发现基因在3'侧翼区有3 个突变位点，分别为'GA、'TC、'CT，将这3 个位点的基因型频率以及等位基因频率通过卡方检验（表3），证实这3个突变位点均符合哈迪-温伯格定律。

表3 RBP5 基因多态性位点基因型频率和等位基因频率

图5 RBP5 基因突变位点测序峰图

3 讨论

机体中的脂肪一部分被消化吸收，另一部分被消化后进入肝脏，转变为体脂而贮存。当机体饥饿时，贮存在体内的体脂可先被运送到肝脏，进行分解利用。肝脏是体内脂肪酸、胆固醇、磷酯合成的主要器官之一，而脂肪肝就是在脂肪代谢紊乱时，脂肪堆积于肝脏内而形成的疾病。付言峰等人研究发现，肾脏中相对不易发生脂肪沉积，由本实验结果推测基因在肾脏中的高表达促进了脂肪代谢，导致脂肪沉积能力较弱。陈究成等通过对嵊县花猪全基因组测序，进行功能选择信号检测，筛选出候选基因，证明基因在脂肪代谢通路中发挥重要的作用。在本研究中发现，藏猪和大约克夏猪的基因在肾脏、肝脏中的表达量都高于脂肪组织，推测基因高表达可能会促进脂肪的代谢，以保护肝脏和肾脏的正常功能，也是造成藏猪和大约克夏猪脂肪沉积能力差异的原因之一。公维华也认为RBP5 与脂肪细胞的分化和发育有关，其在多个不同群体的猪中进行RBPs 家族基因SNPs 研究中发现，基因在脂肪组织中表达量很低，与本研究结果一致。在本研究的半定量结果中也发现基因mRNA 相对表达量在腹脂中表达量最低，推测这可能是造成猪的腹脂含量较高的原因之一。本研究选用180 日龄藏猪和大约克夏猪为研究对象，6～12 月龄是猪脂肪发育的高峰期，此时猪的腹脂组织中基因表达量几乎到最低，本实验结果符合猪的生长发育规律。

本实验在猪基因的3'侧翼区发现3 个SNPs位点，分别为'G274A、'T278C、'C346T，且这3 个位点的基因频率和基因型频率在藏猪与大约克夏猪中存在极显著差异。由多态性位点和实时荧光定量PCR 结果可知，这3 个位点的多态性结果与实时荧光定量PCR结果差异显著性趋势一致，由此推测，猪基因的3 个位点可能是调控猪脂肪代谢的关键功能位点，但具体调控机制还需进一步研究。

4 结论

本研究通过实时荧光定量PCR 和SNPs 位点筛选发现，基因在肾脏组织中表达量高，3'侧翼区发现'G274A、'T278C、'C346T 3 个突变位点，推测这3个突变位点可能是调控基因表达的关键功能位点。本研究结果为基因在脂肪代谢调控机制方面的后续研究提供了可靠依据。