辽育白牛无角性状的分子鉴定

尚嵩洋，王昱彤，杨术环，刘 全，张丽君，李 宁，杜学海，王大鹏，金双勇，王 喆，张树义*

（1.沈阳农业大学动物科学与医学学院，辽宁沈阳 110866；2.辽宁省农业发展服务中心，辽宁沈阳 110033）

辽育白牛是以夏洛莱牛为父本、辽宁本地黄牛为母本，经40 余年的培育形成的特色肉牛品种，其全身被毛白色或草白色，具有体型大、增重快、肉质好的特点。2010 年，辽育白牛获得国家肉牛新品种认定，是我国第3 个专门化肉牛品种。在品种育成初期，多数辽育白牛为有角牛，少数为无角牛（图1）。在随后的扩繁和推广过程中无角辽育白牛逐渐受到青睐，但其无角性状的形成机制尚不清楚。

图1 无角和有角辽育白牛

以往研究牛无角性状是由1 号染色体发生的显性突变所致。Medugorac 等对夏洛莱牛、安格斯牛等多个品种无角牛进行了高通量测序，发现它们的1 号染色体都存在1 个或2 个拷贝212 bp 的插入片段（P），该片段替换掉了原位置的10 bp 序列导致了无角性状的出现。荷斯坦牛的无角性状则是由1 号染色体上的5 个突变位点（P、P、P、P和P）连锁控制，该连锁突变为荷斯坦牛特有。Medugorac 等发现土雷诺蒙古利亚牛的无角性状是由1 号染色体的一段219 bp 的重复插入序列造成的（P）。对无角云岭牛和夏南牛的研究显示它们的无角性状都是由于P位点的突变所致。为探究辽育白牛无角性状的成因，研究对辽育白牛的P和P位点进行了检测，对分型结果进行了统计分析，以期为辽育白牛无角新品系的选育工作提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料 本研究共采集辽育白牛血液及精液样品304份（沈阳牧经种牛繁育中心有限公司44 份、彰武长青牧业96 份、黑山绿源肉牛养殖场89 份、阜蒙福泽肉牛养殖有限公司43 份、喀左兴泰肉牛养殖厂32 份），其中182 份为无角辽育白牛样品，122 份为有角辽育白牛样品；另采集无角夏洛来牛血液样品4 份。精液样品采用液氮保存，血液样品-20℃保存。

1.2 试剂与仪器 血液/细胞/组织基因组DNA 提取试剂盒，购自天根生化科技有限公司（北京）；精子基因组DNA 提取试剂盒，购自北京百奥森泰生物技术有限公司（北京）；2×EasyTaq MasterMix 扩增酶，购自北京全式金生物。超微量分光光度计（Thermo Fisher Scientific，NanoDrop 2000）；PCR 扩增仪（Applied Biosystems，ProFlex PCR systems）；电泳仪（北京六一生物科技有限公司，DYY-7C）；凝胶成像仪（北京赛智创业科技有限公司，ChampGel 5000plus）。

1.3 方法

1.3.1 样品DNA 提取 根据试剂盒说明书提取样本DNA，用1%琼脂糖电泳检验DNA 条带是否清晰明亮，使用超微量分光光度计检测样品OD 值和浓度。将合格样品DNA 分装保存于-20℃冰箱，用于后续实验。

1.3.2 PCR 扩增反应 研究以辽育白牛和夏洛莱牛基因组DNA 为模板，采用文献的引物扩增无角性状位点P和P。P位点上游引物：5'-TCAAGAAG GCGGCACTATCT-3'，下游引物：5'-TGATAAACTGA CCCTCTGCCTATA-3'；P位点上游引物：5'-TGAAA CTTTTGGCAAGCATGA-3'，下游引物：5'-CTGTGTCT CCTCGTGAGTCC-3'。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR 反应体系15 μL，包括1 μL DNA 模板（20～100 ng/μL），7.5 μL 2×EasyTaq MasterMix扩增酶，上下游引物各1 μL（10 μmol/L），4.5 μL 灭菌去离子水。PCR 反应程序：94 ℃预变性10 min；94℃变性30 s，56℃（P）或59℃（P）退火30 s，72℃延伸1 min，循环30 次；72℃延伸10 min，4℃保存。实验使用扩增仪进行PCR 扩增。

1.3.3 PCR 产物凝胶电泳及测序 PCR 产物使用2%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增条带，使用1×50TAE 电泳缓冲液，电泳电压100V，电泳40 min，在凝胶成像仪下拍照观察电泳结果，判断样品分型。为验证琼脂糖电泳的分型结果，本研究在有角辽育白牛P和P位点的PCR 产物中，每个位点随机抽取30 份进行测序；在无角辽育白牛P位点为杂合突变型的PCR 产物中随机抽取30 份进行测序；2 个位点其余分型样品的PCR 产物则均进行了测序。另外，采用文献引物对8 头P和P位点为纯合无突变型的无角辽育白牛进行了连锁突变位点（P、P、P、P和P）的分子鉴定。P、P、P和P位点采用PCR 产物测序，P位点采用克隆测序。委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，使用MEGA v 6.0 软件读取测序结果。

2 结果与分析

本研究应用P和P位点对所采集的有角、无角辽育白牛和无角夏洛莱牛进行分子鉴定。根据琼脂糖凝胶电泳条带判断样品分型，结果见表1。P和P位点不同分型电泳条带如图2 所示。在182 头无角辽育白牛中，7 头为P位点纯合突变型，其频率为3.85%；164 头为P位点杂合突变型，其频率为90.11%；3 头为P位点杂合突变型，其频率为1.65%；其余8 头则未携带P和P位点突变，对这8 头牛进行了P、P、P、P和P位点的分子鉴定，结果显示它们也未携带以上任意位点的突变。未发现同时携带P和P位点突变的无角辽育白牛。122 头有角辽育白牛则均为P和P纯合无突变型。4 头无角夏洛莱牛则均为P位点杂合突变型。PCR 产物测序的结果与琼脂糖电泳的分型结果一致。

图2 辽育白牛P202ID 和P219ID 分型检测结果

表1 辽育白牛P202ID 和P219ID 位点分型结果统计

3 讨论

我国畜牧业转型正处于关键时期，坚持自主创新、培育适应市场需求的地方品种、提高畜禽种业经济效益是我国现代畜牧业的发展目标。辽育白牛是历经40 余年自主培育的特色肉牛品种，其体型大、发育快、肉质好，具有良好的市场基础，高峰时期良种母牛数量曾达2 万头以上。但是，目前辽育白牛的饲养规模受到西门塔尔牛的严重冲击，良种母牛数量和养殖规模都在不断下降，如何提高辽育白牛市场竞争力，扩大饲养规模是辽育白牛繁育工作面临的主要问题。近年来，由于无角辽育白牛具有不易争斗、节省饲养空间、饲养安全性好等优点，逐渐受到养殖户欢迎。培育辽育白牛无角新品系有望提高其市场竞争力、扩大饲养规模。

研究通过牛无角位点P和P对182 头无角和122 头有角辽育白牛进行了分子鉴定，分型显示在182 头无角辽育白牛中，绝大多数（93.96%）都携带1个或2 个拷贝的P位点插入突变。另外检测的4 头无角夏洛莱牛同样携带1 个拷贝的P位点插入突变，与Medugorac 等结果一致。结合辽育白牛的培育历史，推测无角辽育白牛P位点的突变很可能源自夏洛莱牛。在3 头无角辽育白牛中检测到了P位点的插入突变。这一突变位点最早在土雷诺蒙古利亚牛中发现，在蜀宣花牛中也有检测到，推测可能源自本地黄牛。研究表明，蒙古牛的无角性状也是由P位点的突变所导致；另有8 头无角辽育白牛则既未携带P和P位点突变，也未携带荷斯坦牛的无角连锁突变。该结果可能存在其他未知基因或位点的突变导致这8 头辽育白牛的无角性状，其具体形成机制仍有待研究。

4 结论

本研究应用P和P位点对182 头无角辽育白牛进行了分子鉴定，其中171 头（93.96%）携带P位点插入突变，3 头（1.65%）携带P位点插入突变，其余8 头（4.4%）则既未携带P和P位点突变，也未携带荷斯坦牛的无角连锁突变，其成因仍有待深入研究。本研究的鉴定结果可为辽育白牛无角新品系的育种工作提供技术支持。