血IL-35、IL-17和Th17/Treg在特发性膜性肾病中的表达及其意义

白运焕　邓娜　王涵　王涛　陈葶　陈茂杰

[摘要] 目的 檢测特发性膜性肾病（IMN）患者外周血白细胞介素-35（IL-35）、白细胞介素-17（IL-17）浓度及Th17/Treg比值，探讨其在IMN发生发展中的作用及意义。方法  选择2018年8月至2020年3月于江苏省徐州市中心医院肾内科住院初诊未经治疗的特发性膜性肾病患者60例作为IMN组，按KDIGO指南分为低、中、高风险组;另选取健康者20名作为对照组。收集一般临床资料和生化数据、24 h尿蛋白定量（24 h Upro）、流式细胞仪检测外周血Th17与Treg、ELISA方法检测血浆中的IL-35、IL-17。IL-35、IL-17、Th17/Treg作因变量，ALB、BUN、Cr、24 h Upro作自变量进行相关分析。结果  ①IMN组的血清IL-35水平低于对照组，且IMN组中，高风险组<中风险组<低风险组（P<0.05）;与IL-17、Th17/Treg、24 h Upro、Cr、BUN呈负相关（P<0.05），与ALB呈正相关（P<0.01）。②IMN组的血清IL-17水平、Th17/Treg均高于对照组，且IMN组中，高风险组>中风险组>低风险组（P<0.05）;与24 h Upro均呈正相关（P<0.05），与ALB均呈负相关（P<0.05）。结论  在特发性膜性肾病中Th17/Treg表达失衡，倾向Th17，IL-17水平随病情加重而升高，IL-35水平随病情加重而下降，提示特发性膜性肾病在病情进展中促炎因子表达增强而抗炎因子表达减弱。

[关键词] 特发性膜性肾病;IL-35;IL-17;Th17/Treg

[中图分类号] R692          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2022）15-0008-04

Expression and significance of blood IL-35， IL-17 and Th17/Treg in idiopathic membranous nephropathy

BAI Yunhuan DENG Na WANG Han WANG Tao CHEN Ting CHEN Maojie

Department of Nephrology， Xuzhou Central Hospital in Jiangsu Province， Xuzhou 221000， China

[Abstract] Objective To detect the concentration of interleukin 35 （IL-35） and interleukin 17 （IL-17） and the ratio of Th17/Treg in peripheral blood of patients with idiopathic membranous nephropathy （IMN）， and to explore their roles and significance in the occurrence and development of IMN. Methods A total of 60 patients with initial diagnosed untreated idiopathic membranous nephropathy hospitalized in the Department of Nephrology of Xuzhou Central Hospital in Jiangsu Province from August 2018 to March 2020 were selected as the IMN group. They were divided into the low-risk group， the medium-risk group， and the high-risk group according to the KDIGO guideline. Another 20 healthy people were selected as the control group. The general clinical data， biochemical data， and 24-hour urine protein quantification （24 h Upro） were collected. Flow cytometry was used to detect Th17 and Treg in peripheral blood. ELISA method was used to detect IL-35 and IL-17 in plasma. The IL-35， IL-17， and Th17/Treg were used as dependent variables， and ALB， BUN， Cr， and 24 h Upro were used as independent variables for correlation analysis. Results ①The serum IL-35 level in the IMN group was lower than that in the control group， and the serum IL-35 level in the high-risk group was lower than that in the middle-risk group， and the serum IL-35 level in the middle-risk group was lower than that in the low-risk group （P<0.05）. The serum IL-35 level was negatively correlated with IL-17， Th17/Treg， 24 h Upro， Cr， and BUN （P<0.05）， and positively correlated with ALB （P<0.01）. ②The serum IL-17 level and Th17/Treg in the IMN group were higher than those in the control group， and the serum IL-17 level and Th17/Treg in the high-risk group were higher than those in the middle-risk group， and the serum IL-17 level and Th17/Treg in the middle-risk group were higher than those in the low-risk group （P<0.05）. The serum IL-17 level and Th17/Treg were positively correlated with 24 h Upro （P<0.05）， and negatively correlated with ALB （P<0.05）. Conclusion Th17/Treg expression is unbalanced in idiopathic membranous nephropathy. With the severity of the disease， Th17 and IL-17 levels increase， and IL-35 level decreases， suggesting that with the progression of idiopathic membranous nephropathy， the expression of pro-inflammatory factors is enhanced while the expression of anti-inflammatory factors is weakened.7CEC5C62-5815-494D-9E31-8D6FFC5082D0

[Key words] Idiopathic membranous nephropathy; IL-35; IL-17; Th17/Treg

特发性膜性肾病（idiopathic membranous nephropathy，IMN）以肾小球基底膜上皮细胞下弥漫的免疫复合物沉积伴基底膜弥漫增厚为病理特点，是免疫介导的肾脏炎性病变，辅助性Th17细胞（Th17）和调节性T细胞（Treg）参与特发性膜性肾病发病，Th17/Treg二者失衡与其病情严重程度相关，外周血Treg、Th17含量变化对病情评估及临床疗效有重要意义[1-2]。白细胞介素-17（interleukin17，IL-17）是Th17分泌的具有激活、介导参与炎症反应的细胞因子，在IMN的发生发展中起到重要作用。白细胞介素-35（interleukin 35，IL-35）是Treg分泌的免疫抑制性细胞因子[3]，是感染、肿瘤、免疫性疾病研究的热点。目前，IL-17、TH17/Treg的变化及IL-35的表达在IMN尚未见报道。本研究通过检测尚未接受治疗的IMN患者外周血中的IL-35、IL-17表达水平及Th17/Treg比值变化，观察其在IMN发生发展中的作用，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象及分组

选择2018年8月至2020年3月江苏省徐州市中心医院肾内科收治的患者60例作为IMN组。其中男36例，女24例;平均年龄（57.11±2.21）岁。纳入标准：①肾穿刺病理诊断为特发性膜性肾病。②受试前未接受过糖皮质激素、免疫抑制剂及细胞毒类药物治疗。③按2021年KDIGO指南IMN危险程度分级分组[4]：低风险组：eGFR正常，蛋白尿<3.5 g/d和（或）血清白蛋白>30 g/L;中风险组：eGFR正常，蛋白尿>4 g/24 h，但<8 g/24 h，血清抗磷脂酶A2受体抗体（PLA2R-Ab）<50 RU/ml;高风险组：eGFR<60 ml/min/1.73 m²，蛋白尿>8 g/24 h，PLA2R-Ab>150 RU/ml。排除标准：①患有病毒肝炎、系统性红斑狼疮、血液及实体肿瘤等引起的继发性膜性肾病者;②严重肾功能不全者;③有糖尿病、高血压病、心脑血管疾病等慢性病史者;④存在严重感染者。另选取20名健康者作为对照组，排除重要脏器疾病、感染、免疫性疾病及恶性肿瘤等。其中男10例、女10例，平均年龄（51.42±2.76）岁。

1.2 方法

①收集患者一般资料，抽取静脉血用全自动生化分析仪（购自德国罗氏公司）测定白蛋白（ALB），总胆固醇（TC），甘油三酯（TG），血肌酐（Scr），尿素氮（BUN），24 h尿蛋白定量（24 h Upro），计算估计肾小球滤过率[eGFR（ml/min）];外送广州金域检验公司检测血清抗磷脂酶A2受体抗体（PLA2R-Ab）滴度。②细胞因子检测：南京贝斯特生物科技有限公司提供的试剂盒，血浆细胞因子IL-35、IL-17检测采用酶联免疫吸附法测定，严格按照说明书进行操作。③Th17、Treg细胞流式检测：细胞仪从美国BD公司购买，检测外周血Th17与Treg比值。④以IL-35、IL-17及Th17/Treg作因变量，ALB、24 h Upro、肌酐（SCr），尿素氮（BUN）作自变量进行相关分析。

1.3 统计学方法

应用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）或t检验，两因素相关分析采用Spe-arman相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料

与对照组比较，IMN组的ALB、eGFR、IL-35水平均较低，SCr、IL-17、24 h Upro、PLA2R-Ab（阳性率）均较高，大部分患者表现为有低白蛋白（<30 g/L），高脂血症，大量蛋白尿（>3.5 g/24 h），符合肾病综合征的诊断标准，差异有统计学意义（P<0.01）。见表1。

2.2 IMN组不同危险分层与对照组的IL-35、IL-17和Th17/Treg水平比较

与对照组比较，IMN组的IL-17、Th17/Treg水平均较高，IL-35水平较低，差异有统计学意义（P<0.05）;且IMN组中，随着危险级别的增加，IL-17、Th17/Treg水平越高，IL-35水平越低，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.3 IMN组的IL-35与IL-17、Th17/Treg相关关系

IMN组患者的血清IL-35与IL-17（r=-0.812，P<0.05）、Th17/Treg（r=-0.487，P<0.01）均呈负相关。

2.4 IL-35与相关指标相关分析

IL-35与ALB呈正相关，与24 h Upro、Cr、BUN呈明显的负相关;IL-17与ALB呈负相关，与24 h Upro呈正相關，与Cr、BUN无明显的相关关系;Th17/Treg与ALB呈负相关，与24 h Upro呈正相关，与Cr、BUN无明显的相关关系。见表3。

3 讨论

Th17和Treg细胞由初始的CD4⁺的T细胞分化而来。Th17细胞分泌IL-17、IL-23、IL-6等多种促炎因子。其中IL-17能与多种细胞如内皮细胞、上皮细胞、造血细胞等表面的IL-17受体结合，产生炎症趋化因子，聚集中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞发生炎症反应而导致组织损伤。在肾脏病体外研究中，发现IL-17可诱导肾小管上皮细胞和内皮细胞表达下游促炎因子如IL-1β、TNF-α和单核细胞趋化蛋白-1，还能与这些细胞因子协同作用，以促进肾脏免疫炎症和导致肾小球硬化的发生发展，同时IL-17可通过上调细胞间黏附分子-1的表达，激活肾脏局部的Th17细胞，进而加重肾脏病理损伤[5-6]。这些改变在临床研究中得到验证，成人原发性肾病综合征患者与对照组相比，IL-17水平明显更高，经治疗后IL-17水平较治疗前明显降低（P<0.05）[7]。在儿童肾病综合征患者中也显示同样结果[8]。IL-35是Treg细胞分泌的抗炎因子，2007年Collison等首次报道其分子结构，是由α链p35和β链EB病毒诱导基因3（EBI3）组成的异源二聚体蛋白，是IL-12家族新成员。研究表明，IL-35在自身免疫性疾病、肿瘤和传染性疾病中起重要作用[9-10]。IL-35至少有四种生物学作用：①抑制T细胞增殖;②将幼稚T细胞转化为诱导型调节性T细胞（iTr35）增强免疫调控能力;③下调Th17细胞功能，减轻炎症反应;④将Breg细胞转化为产生IL-35和IL-10的Breg亚群，增加抗炎作用。IL-35在肾脏病方面的研究偶有报道，相关研究发现狼疮性肾炎（LN）患者血清IL-35水平减低而IL-17水平升高[11]。IL-35水平与尿蛋白定量和血肌酐呈负相关，和肾小球滤过率呈正相关。抗炎因子的降低而致炎因子的升高导致肾脏病变加重。Roccatello等[12]统计发现利妥昔单抗治疗IMN缓解患者的Treg细胞，12个月后可升至基线值的10倍，抗磷脂酶A2受体抗体（PLA2R-Ab）阳性者比阴性者更低，经治疗后PLA2R-Ab阳性者IL-35的血清水平与基线水平相比显著升高，该作者认为Tregs和IL-35水平可作为IMN患者对RTX反应的预测指标。大量资料显示Th17/Treg二者之间存在动态平衡。一旦失衡则产生病理状态。有众多的文献报道Th17在IMN患者中的百分比高于健康志愿者，而Treg低于健康志愿者，且病情越严重，Th17/Treg越向Th17偏移，提示高水平Th17/Treg与IMN发病及病情有关[13]。IMN中Treg细胞的抑制受损[14]，自身免疫耐受能力下降，最终导致IL-35等抗炎因子的降低而促炎因子的升高加重肾脏病变。7CEC5C62-5815-494D-9E31-8D6FFC5082D0

本研究观察初次诊断尚未治疗IMN患者，结果显示：Th17/Treg比值较正常对照组明显升高，IMN患者中Th17和IL-17与ALB呈负相关，与24 h Upro呈正相关关系;Treg和IL-35与ALB呈正相关关系，与24 h Upro、Cr、BUN呈明显的负相关，结果显示与以上文献报道一致。PLA2R-Ab是诊断特发性膜性肾病、判断疾病严重程度、指导治疗、判断预后的重要指标，膜性肾病危险分级越高，提示肾脏炎症反应越重[4]，IL-35水平是重要的免疫抑制因子，病情越重水平越低，提示危险分层越高，IL-35水平越低，既往无该方面的研究，本研究设想对不同分组的IL-35比较，证实不同危险分层，IL-35水平不同，结果显示，IMN患者高风险组的IL-17、Th17/Treg较中风险组高，中风险组较低风险组高;高风险组的IL-35水平较中风险组低，中风险组较低风险组低，差异有统计学意义（P<0.05）。结果提示随着IMN病情进展风险的增加，Th17细胞占据优势，炎症因子分泌增多;而Treg细胞数量减少使抗炎因子降低，二者失衡导致IMN的进展，调整二者的平衡至关重要[15]。但本文观察的病例数有限，还需进一步扩大样本量加以验证，可望加深对IMN发病原理的认识同时发现更多的治疗靶点。

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（收稿日期：2021-10-21）7CEC5C62-5815-494D-9E31-8D6FFC5082D0