子宫内膜非典型增生中TRF1、TRF2和H3K27me3的表达及意义

郭慧 谭丽珊 梁春燕 吴立琦 陈玉英

[摘要] 目的 探讨端粒重复序列结合因子1（TRF1）、端粒重复序列结合因子2（TRF2）和组蛋白H3K27三甲基化（H3K27me3）免疫组化在子宫内膜非典型增生组织中的诊断作用。方法  收集2016年3月至2018年11月广东省韶关市第一人民医院诊断的不伴子宫内膜非典型增生标本30例和子宫内膜非典型增生标本60例及子宫内膜样癌30例。利用免疫组化SP法检测TRF1、TRF2及H3K27me3在这些标本中的表达情况。结果  TRF1、H3K27me3、TRF2在子宫内膜非典型增生组中的表达率分别为35.00%（21/60）、43.33%（26/60）、71.67%（43/60），在不伴非典型子宫内膜增生组的表达率83.33%（25/30）、73.33%（22/30）、30.00%（9/30），在子宫内膜样癌组中的表达率为30.00%（9/30）、36.67%（11/30）、76.67%（23/30）。子宫内膜非典型增生与不伴非典型子宫内膜增生表达率比较，差异有统计学意义（P<0.05）;子宫内膜非典型增生与子宫内膜样腺癌表达率比较，差异无统计学意义（P>0.05）。结论  子宫内膜非典型增生TRF1及H3K27me3低表达，TRF2高表达，联合TRF1、TRF2和H3K27me3有助于鉴别不典型子宫内膜增生与不伴有非典型子宫内膜增生，有助于子宫内膜非典型增生的早期诊断，推荐在常规病理工作中使用。

[关键词] 子宫内膜非典型增生;TRF1;TRF2;H3K27me3;诊断

[中图分类号] R364.3+1;R711          [文献标识码] A          [文章編号] 1673-9701（2022）13-0001-03

[Abstract] Objective To investigate the effects of telomere repeat binding factor 1 （TRF1）， telomere repeat binding factor 2 （TRF2） and histone H3K27 trimethylation （H3K27me3） immunohistochemistry in the diagnosis of endometrial atypical hyperplasia tissues. Methods A total of 30 specimens without endometrial atypical hyperplasia， 60 specimens with endometrial atypical hyperplasia， and 30 specimens with endometrioid carcinoma were collected in Shaoguan First People′s Hospital in Guangdong Province from March 2016 to November 2018. The immunohistochemical SP method was used to detect the expressions of TRF1， TRF2 and H3K27me3 in these specimens. Results The expression rates of TRF1， H3K27me3， and TRF2 in the group with atypical endometrial dysplasia were 35.00% （21/60）， 43.33% （26/60）， and 71.67% （43/60）， respectively. The expression rates in the group without atypical endometrial hyperplasia were 83.33% （25/30）， 73.33% （22/30）， and 30.00% （9/30）， respectively. The expression rates in the group with endometrioid carcinoma were 30.00% （9/30）， 36.67% （11/30）， and 76.67% （23/30）， respectively. There were statistically significant differences in the expression rates between the group with atypical endometrial hyperplasia and the group without atypical endometrial hyperplasia （P<0.05）. There were no statistically significant differences in the expression rates between the group with atypical endometrial hyperplasia and the group with endometrioid carcinoma （P>0.05）. Conclusion TRF1 and H3K27me3 are low-expressed in endometrial atypical hyperplasia， and TRF2 is high-expressed. The combination of TRF1， TRF2 and H3K27me3 can help distinguish the group with endometrial atypical hyperplasia from the group without endometrial atypical hyperplasia， which is helpful in early diagnosis of endometrial atypical hyperplasia. It is recommended in routine pathological practice.4AB23247-607D-40CA-BF76-62F0E29BF349

[Key words] Endometrial atypical hyperplasia; TRF1; TRF2; H3K27me3; Diagnosis

子宫内膜非典型增生（endometrial atypical hyperplasia，EAH）是子宫内膜在无抵抗的雌激素刺激下过度增生，且被覆的腺上皮细胞失去极性出现非典型性。Kurman等[1]发现，在不伴子宫内膜非典型增生中，1.6%的病例进展为癌;而子宫内膜非典型增生进展为癌的风险为15%～28%[1-2]。其中年轻患者约占1%～15%，大多是早期子宫内膜样腺癌，而高达70%的育龄期患者确诊时仍未生育[3];其他子宫内膜增生患者无一例发生癌变。近年来越来越多的有生育要求的EAH患者，希望在病变缓解后实现生育。因此，判断子宫内膜是否具有非典型性以及EAH的早诊断、早治疗的意义就很重要。本研究运用免疫组织化学染色技术探讨TRF1，TRF2和H3K27me3在不伴子宫内膜非典型增生、子宫内膜非典型增生、子宫内膜样癌中的表达情况，旨在寻找子宫内膜非典型增生的早期筛查方法，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料

收集2016年3月至2018年11月广东省韶关市第一人民医院诊断性刮宫或子宫切除标本120例，其中不伴子宫内膜非典型增生30例，年龄40～65岁，子宫内膜非典型增生60例，年龄25～55岁，子宫内膜样癌30例，年龄53～67岁。所有标本术前3个月均未接受放化疗及激素治疗，诊断结果均由2名高级职称的病理医师双盲确诊一致。所有纳入本课题的对象均知情同意，且通过医院医学伦理委员会审核批準。

1.2 主要试剂

TRF1，TRF2购于美国Abcam公司，TRF1的批号为20114010G，TRF2的批号为20114020G，鼠抗人Histone H3K27me3单克隆抗体购于厦门通灵生物医药科技有限公司，批号为：20715391G，三种抗体均为稀释液（即用型）。

1.3 免疫组化及判定结果

所有组织均经常规石蜡包埋、组织切片，采用免疫组织化学Sp法检测组织中的TRF1，TRF2，H3K27me3表达。判定结果：TRF1蛋白在子宫内膜细胞浆中表达，TRF2蛋白在子宫内膜细胞浆及细胞核中均不同程度表达，H3K27me5在子宫内膜细胞核中表达。再根据阳性细胞百分比及染色强度分别计分判定TRF1、TRF2、H3K27me3的染色结果：①阳性染色强度：0分无染色，1分淡黄色，2分棕黄色，3分棕褐色;②阳性细胞比例：0分≤10%;1分 11%～50%;2分51%～75%，3分>75%。两者相乘后积分：0分（-）、1～2分（+）、3～4分（++），5～9分（+++）。免疫组化结果见封三图1～9。

1.4 统计学方法

采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析，计数资料以[n（%）]表示，采用χ2检验，相关性分析应用Spearman秩相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TRF1、TRF2、H3K27me3在不同子宫内膜中的表达

不伴子宫内膜非典型增生的TRF-1、H3K27me3阳性表达率分别为83.33%、73.33%，明显高于在子宫内膜非典型增生（35.00%、43.33%）与子宫内膜样癌（30.00%、36.67%）中的表达，差异均有统计学意义（P<0.01）。不伴子宫内膜非典型增生的TRF2阳性表达率为30.00%，明显低于在子宫内膜非典型增生（71.67%）与子宫内膜样癌（76.67%）中的表达，差异均有统计学意义（P<0.001）。子宫内膜非典型增生的TRF1、TRF2、H3K27 me3阳性表达率分别为35.00%、71.67%、43.33%，与子宫内膜样癌的阳性表达率（30.00%、76.67%、36.67%）比较，差异均无统计学意义（P=0.635，P=0.613，P=0.545）。见表1。

2.2 不伴子宫内膜非典型增生与子宫内膜非典型增生中TRF1、TRF2蛋白表达的相关性

Spearman相关分析显示：在30例不伴子宫内膜非典型增生中，TRF1、TRF2蛋白表达呈负相关性（rs=-0.462，P<0.05）。而在60例子宫内膜非典型增生中，TRF1、TRF2蛋白表达呈负相关性（rs=-0.509，P<0.05）。见表2～3。

2.3 在子宫内膜非典型增生组中H3K27me3表达与TRF1、TRF2蛋白表达的关联分析

Peasrson卡方检验显示，60例子宫内膜非典型增生组中，H3K27me3表达阳性与TRF1蛋白阳性存在正性关联（χ2=34.32，r=0.763，P<0.001），H3K27me3表达阳性与TRF2蛋白阳性表达存在负性关联（χ2=11.37，r=-0.439，P<0.01）。

3 讨论

子宫内膜非典型增生（EAH）作为子宫内膜样癌（endometrioid carcinoma，EC）的前驱病变，两者在分子遗传学水平上表现为一个疾病的连续性不同阶段[4]。据报道，子宫内膜样癌的发生，遵循从不伴子宫内膜非典型增生（endometrial hyperplasia，EH）→子宫内膜非典型增生/子宫内膜上皮内瘤变（endometrial intrepithelial neoplasia，EIN）→子宫内膜样癌的过程[5]。现在子宫内膜非典型增生患者越来越多，年龄越来越年轻，有统计显示约3%～5%的患者年龄在40岁以下[6]。因此早期发现子宫内膜非典型增生非常必要。本研究通过H3K27me3、TRF1、TRF2蛋白在子宫内膜非典型增生中的不同表达，可早期诊断EAH，从而为临床医生对子宫内膜非典型增生的早期预防和治疗提供依据，具有重要的临床实用价值。4AB23247-607D-40CA-BF76-62F0E29BF349

分子生物學研究表明端粒是由重复的TTAGGG序列及端粒结合蛋白所组成，其功能是确保阻止内源性或外源性因子对染色体结构的破坏，阻止细胞凋亡引起的染色体损伤，从而维持染色体的完整性[7]。细胞端粒功能异常是导致细胞异变，继而引发癌症发生的重要原因[8-9]。

TRF1和TRF2是两种不同的端粒结合因子。TRF1通过与端粒DNA末端的特异性结合来改变端粒的结构，从而以顺式作用方式抑制端粒酶与端粒的结合，达到阻止端粒延长的目的，影响细胞的癌变[10]。TRF2能够保持端粒长度动态平衡，保持端粒结构稳定，正性影响细胞癌变进程。国外研究表明，恶性肿瘤组织TRF1的表达明显降低，而TRF2较正常组织明显增高[11]。赵鹏等[12]发现胃癌组织中TRF2蛋白表达较正常胃黏膜组织增高，TRF1蛋白表达较正常胃黏膜组织降低。陈向等[13]的研究表明，TRF2在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织，TRF1在肝癌组织中的表达明显低于癌旁组织。国内在肝癌、宫颈癌及胃癌等肿瘤与TRF1、TRF2的相关性研究中大多也得出类似结果：TRF1蛋白在癌前病变和癌组织中的表达低于正常组织及癌旁组织; TRF2蛋白在癌前病变和癌组织中的表达高于正常组织及癌旁组织。研究发现，子宫内膜非典型增生中的TRF2表达明显增高，TRF1表达降低。TRF1蛋白表达的降低可能与端粒酶的激活有关，较少的TRF1蛋白允许更多的端粒酶接近端粒DNA以延长缩短的端粒，而TRF2蛋白表达的上调则参与了端粒长度的负性调节和结构的维持;TRF1、TRF2表达的改变共同作用于端粒的动态平衡，从而导致子宫内膜不典型增生。

表观遗传是在基因的DNA序列不发生变化的条件下，基因功能发生可遗传的变化，其主要发生机制包括DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA调控、染色质结构重构等[14]。组蛋白H3K27me3的修饰是表观遗传中重要的基因沉默标志，参与调节细胞分化与增殖之间的平衡，其表达失衡可导致细胞增殖分化失控，进而导致肿瘤的发生[15-16]。H3K27me3由多梳抑制复合物2（polycomb repressive complex 2，PRC2）产生，PRC2由EZH2、胚胎外胚层发育蛋白（embryonic ectoderm development，EED）和胚胎肝细胞抑制蛋白（suppressor of zeste，SUZ12）三部分核心亚基组成。PRC2的改变会导致H3K27me3表达失衡。WEI等[17]发现在乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌患者中H3K27me3的表达缺失。本研究发现，H3K27me3在不伴子宫内膜非典型增生组织中高表达，而在子宫内膜非典型增生组织中低表达，表达缺失。H3K27me3的表达缺失，可能是EZH2通过抑制E-钙黏蛋白的表达，进一步丧失催化H3K27三甲基化的能力，引起H3K27me3表达水平下调，从而导致肿瘤的发生。

综上所述，TRF1、H3K27me3在子宫内膜非典型增生中低表达，明显低于不伴子宫内膜非典型增生，而TRF2在子宫内膜非典型增生中高表达，明显高于不伴子宫内膜非典型增生。TRF1与TRF2在子宫内膜非典型增生中呈负相关，二者通过负向调控促进子宫内膜非典型增生病变的发生发展。H3K27me3在非典型子宫内膜增生中低表达。通过三者的联合检测，可以早期发现子宫内膜非典型增生的患者，从而指导临床早期治疗，降低患者的癌变率。因本研究选取样本量较少，三者在肿瘤的发生中的相互作用有待进一步研究。

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（收稿日期：2021-08-23）4AB23247-607D-40CA-BF76-62F0E29BF349