16S rRNA在常见致病分枝杆菌菌种鉴定中的应用*

纪凌云,李马超,蒋 毅,赵秀芹,万康林,王琳琳,刘海灿△

1.同济大学附属东方医院南院检验科,上海 200120；2.中国疾病预防控制中心传染病预防控制所/传染病预防控制国家重点实验室，北京 102206;3.同济大学附属东方医院门诊护理部,上海 200120

非结核分枝杆菌(NTM)指除结核分枝杆菌复合群(包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌)和麻风分枝杆菌以外的所有其他分枝杆菌属,该菌广泛存在于水、土壤和灰尘等自然环境中,为条件致病菌,至今已发现150余种,大约有50种能引起人类疾病[1]。目前研究者对已知分枝杆菌的16S rRNA基因已经全部测序，通过基因比较分析，发现分枝杆菌16S rRNA基因既含有属特异的保守序列，又含有种特异性的高变区。以16S rRNA基因为靶基因，采用PCR测序方法，通过序列的分析可以鉴定分枝杆菌。本研究结合美国国家生物技术信息中心(NCBI)基因库现有的55株常见致病性分枝杆菌16S rRNA序列，以及28株人源和6株牛源NTM分离株16S rRNA测序结果，探讨16S rRNA序列在常见致病性分枝杆菌菌种鉴定中的价值，现报道如下。

1 材料与方法

1.1菌株来源 收集2012-2015年四川人源性19株4种、2014年内蒙古牛源性6株2种、2005-2012年福建人源性6株2种、2010年甘肃人源性2株1种、2015年北京人源性1株1种，共计34株NTM，均为罗氏培养基培养阳性，经噻吩-2-羧酸(TCH)、对硝基苯甲酸(PNB)培养初步鉴定为NTM，再经多位点序列分析及保守基因16S、16S-23S rRNA(ITS)、RNA聚合酶的β-亚基(rpoB)和热休克蛋白65(hsp65)等的测序结果与NCBI序列库比对鉴定到种，并由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所结核室传代保存。具体信息见表1。

表1 临床菌株信息

1.2方法

1.2.1细菌DNA制备 采用水煮法提取DNA，挑取3～4周龄新鲜菌落并用生理盐水洗脱菌体，80 ℃灭菌30 min，离心收集菌体，用500 μL TE缓冲液重新悬菌，沸水浴15 min，12 000 r/min离心3 min，取上清液即为模板DNA，-20 ℃保存备用。

1.2.216S rRNA序列扩增 (1)扩增体系：反应体系总体积25.0 μL，2×Taq Master Mix 12.5 μL，10 μmol/L上下游引物各1.0 μL，双蒸水8.5 μL,DNA 模板2.0 μL。为获得34株NTM的16S rRNA基因全序列，采用正向引物Fd1、反向引物Rp2进行扩增，扩增长度约为1 500 bp，引物由北京天一辉远有限公司合成，引物序列参照文献[2]。正向引物Fd1:5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′；反向引物Rp2：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。将PCR产物送至北京天一辉远有限公司进行双向测序分析。(2)扩增条件为94 ℃预变性10 min，94 ℃变性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30个循环，最后72 ℃延伸10 min。

1.2.316S rRNA序列下载 从NCBI上下载1 324 bp以上23种55株常见致病分枝杆菌及用来建外群的1株诺卡菌16S rRNA全长序列。

1.2.4核苷酸序列分析 采用PCR扩增电泳的方法验证目的片段并将测得的序列输入NCBI数据库，用局部相似性基本查询工具BLAST程序进行比对分析，验证是否为所测菌的16S rDNA 序列。

1.2.516S rRNA进化树的建立及序列分析 将拼接好的34株NTM分离株16S rRNA序列和从NCBI上下载的16S rRNA序列共90条，采用Mega6.0软件中的MUSCLE进行多序列比对，参数保持默认值不变，选择Maximum Likelihood法构建进化树，Bootstrap法生成1 000个重复序列组。种间及种内相似性计算使用DNASTAR/MegAlign中的Clustal W方法完成。

2 结 果

2.1NTM分离株16S rRNA序列PCR扩增电泳结果 34株NTM分离株均可扩增出1条约1 500 bp的条带，与预期片段大小相符，见图1。测序结果大小为1 345～1 362 bp，与NCBI数据库进行比对后发现，不同种的16S rRNA序列与NCBI数据库中现存序列相似性均在99%以上，可见该片段为本实验所要研究的目的片段。

注：M为DNA标志物；1～7为部分NTM分离株16S rRNA序列PCR扩增电泳结果；N为阴性对照。

2.2分枝杆菌16S rRNA序列测定结果

2.2.1验证目的片段 将所测定的34株NTM分离株的16S rRNA序列用NCBI的BLAST程序比对分析，结果显示与分枝杆菌的相似性均达99%，说明扩增片段为目的基因。

2.2.2分枝杆菌16S rRNA序列种间、种内相似性分析 将34条所测NTM 16S rRNA序列和NCBI中55条常见致病分枝杆菌16S rRNA序列导入DNASTAR/MegAlign软件采用Clustal W方法进行多序列比对，以及种内及种间相似性分析。种内、种间两两比对后统计相似性范围，结果显示，种内相似性为99.0%～100.0%，其中脓肿分枝杆菌、鸟分枝杆菌、龟分枝杆菌、偶发分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、玛尔摩分枝杆菌、海鱼分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌、人型分枝杆菌种内相似性均可高达100.0%，种内相似性最小值出现在戈登分枝杆菌种内比较中，为99.0%，提示16S rRNA序列的种内保守性很高。分枝杆菌种间相似性为91.5%～100.0%，其中部分人型分枝杆菌与牛型分枝杆菌、鸟分枝杆菌与胞内分枝杆菌、胃分枝杆菌与堪萨斯分枝杆菌的种间相似性可达100.0%。其次，海鱼分枝杆菌和溃疡分枝杆菌、玛尔摩分枝杆菌与苏尔加分枝杆菌、脓肿分枝杆菌与龟分枝杆菌表现出较高的种间相似性，均在99.4%以上(分别为99.8%、99.8%、99.9%)。蟾分枝杆菌、草分枝杆菌与其他分枝杆菌相比，种间相似性普遍较低，蟾分枝杆菌与其他分枝杆菌比较，相似性为91.5%～94.9%，其中蟾分枝杆菌与龟分枝杆菌相似性仅为91.5%。草分枝杆菌与其他分枝杆菌种间相似性为92.6%～97.2%，其中，草分枝杆菌与蟾分枝杆菌相似性仅为92.6%，草分枝杆菌与耻垢分枝杆菌种间相似性较高，为97.2%。这提示通过16S rRNA序列难以有效区分同一复合体的不同分枝杆菌亚种，但对于其他分枝杆菌种间能得到较好区分。

2.3NTM 16S rRNA系统进化分析结果 以34株临床株测序所得的34条16S rRNA序列和55条从NCBI下载的常见致病分枝杆菌16S rRNA序列，并以诺卡菌作为外群，构建系统进化树，见图2。除了龟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌、鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌和胃分枝杆菌、溃疡分枝杆菌和海鱼分枝杆菌、人型分枝杆菌和牛型分枝杆菌不能分开外，使用16S rRNA可以很好地将常见致病分枝杆菌各种分开，共分为18群。

图2 16S rRNA聚类结果

2.4NTM不同种16S rRNA碱基变异分析 选取本研究所测34株NTM临床分离株16S rRNA序列和从NCBI上下载的所有常见致病性分枝杆菌的16S rRNA序列(若分枝杆菌种内相似性为100%，则合并为1株进行分析)共90条，采用Clustal W分析剪齐后获得的序列大小为1 248 bp。分析易变区，以M.abscessus_ATCC19977作为变异位点的参考序列，分枝杆菌16S rRNA整体保守性较高，存在易变区有7个，分别在40～90、306～352、414～487、706～741、871～890、983～1 017、1 136～1 138碱基位点。具体碱基变异分析见表2。

表2 碱基变异分析

3 讨 论

基于16S rRNA基因的分子生物学检测技术对于NTM感染的诊断和进化分析是非常重要的，尤其对于那些不能培养的或者已经被杀死的菌株[3]。16S rRNA 5′端存在A区和B区，含有针对分枝杆菌的高度变异的核酸序列，使用特异靶基因16S rRNA进行序列分析，已经被广泛接受作为鉴定分枝杆菌的“金标准”。A区序列包含大多数分枝杆菌的种特异序列，通常用作鉴定序列，而后发现的B区序列亦为许多菌种共有，也被证实可用于个别菌种鉴定[4-5]。由于NTM感染后患者可以具有与结核病相似的临床表现，但在治疗和预防上与结核病有明显不同，不同种的NTM对药物的敏感性也不同，因此选择正确和及时的NTM鉴定方法对该病患者的治疗和流行病学研究是迫在眉睫的[1,6]。

近年来，基于16S rRNA建立的鉴定分枝杆菌的方法有很多，如：基于小段16S rRNA高变异区的焦磷酸测序技术，该技术主要用于分枝杆菌种内鉴定，可与16S rRNA基因的桑格测序法相比较，据报道，该方法与其他鉴定方法具有较高的符合率[7]。另外基于16S rRNA寡核苷酸的基因芯片技术也已经被应用，已在鼻腔、上消化道、肠道样品中检测到分枝杆菌的DNA[8]。此外，16S rRNA基因有一段138 bp片段的高度可变区，可用于鉴别已知及新型的分枝杆菌，且其鉴定NTM快速、准确，鉴定种多达40余种，如今已广泛应用于分枝杆菌的鉴定。本次实验中16S rRNA目的片段长度约为1 500 bp，测序所得片段长度在1 340 bp以上，比对剪齐后为1 248 bp，因此覆盖16S rRNA的信息较全面。值得注意的是，本实验使用的34株NTM来自5个地域，且不同地域菌种分布有差异，同一菌种分布于同一地域，无法对NTM的16S rRNA序列进行地域特征的分析。

本研究利用分离株及从NCBI数据库中下载的16S rRNA序列，系统探讨16S rRNA序列在常见致病分枝杆菌菌种鉴定中的应用价值。从系统进化树中可以发现，除了龟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌、鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌和胃分枝杆菌、溃疡分枝杆菌和海鱼分枝杆菌、人型分枝杆菌和牛型分枝杆菌等几个关系较近的菌种不能分开外，使用全长16S rRNA序列可以很好地将13种常见致病性分枝杆菌各种分开。通过种间相似性水平分析可以发现，草分枝杆菌、蟾分枝杆菌与其他分枝杆菌差异较大，而部分人型分枝杆菌与牛型分枝杆菌、鸟分枝杆菌与胞内分枝杆菌、胃分枝杆菌与堪萨斯分枝杆菌的种间相似性最高可达100.0%，其次为脓肿分枝杆菌与龟分枝杆菌(99.9%)、海鱼分枝杆菌和溃疡分枝杆菌(99.8%)、玛尔摩分枝杆菌与苏尔加分枝杆菌(99.8%)。这几种由于相似性极高，很难用16S rRNA鉴别开来，这与之前的相关研究结果相符[9]。但是16S rRNA可以将偶发分枝杆菌、日内瓦分枝杆菌、浅黄分枝杆菌、戈登分枝杆菌、嗜血分枝杆菌、不产色分枝杆菌、草分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、土分枝杆菌、蟾分枝杆菌很好地鉴别开来，因此可以作为一种较好的鉴定分枝杆菌的方法。而通过种内相似性比较，发现其中脓肿分枝杆菌、鸟分枝杆菌、龟分枝杆菌、偶发分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、玛尔摩分枝杆菌、海鱼分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌、人型分枝杆菌种内相似性最高可达100.0%，可见分枝杆菌16S rRNA的种内保守性高。

通过NTM不同种16S rRNA碱基变异的分析，发现存在点突变、缺失突变、插入突变等变异类型。蟾蜍分枝杆菌的特异碱基变异较多，存在2处连续2个碱基的插入，3个单碱基的突变，1处连续2个碱基的缺失。日内瓦分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、浅黄分枝杆菌、草分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、不产色分枝杆菌均存在特异的碱基变异。此外，人型分枝杆菌和牛型分枝杆菌、龟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌作为复合群分别存在特异的碱基变异。根据分枝杆菌特异的碱基变异，构建荧光定量PCR等高灵敏度的分子生物学检测方法，对于分枝杆菌检测及流行病学调查具有重要意义。虽然PCR产物直接测序技术存在一定的错配率，但本实验采用双向测序的方法进行测序，且经北京天一辉远有限公司对测序峰图分析并拼接序列，可有效减少错配事件发生。

虽然在鉴定分枝杆菌方面有一个健全的16S rRNA库，且每种分枝杆菌有一个特异和稳定的16S rRNA序列，但是人们仍不能确定有多少个碱基不同才能区别一个种。据报道，如果16S rRNA不同的碱基数小于5个，或者它们的差异性小于1.5%，则可以认为是相同的种[10]。可见16S rRNA 鉴定方法也存在一定的弊端，基于hsp65的限制性片段长度多态性分析(PRA)方法以及ITS的序列分析均能将16S rRNA不能区分的脓肿分枝杆菌和龟分枝杆菌、胃分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌鉴别开来。因此，联合应用其他分子生物学鉴定方法，会取得更好的效果。