Shh、Smo、Gli1在弥漫性大B细胞淋巴瘤中的表达及临床意义*

时杜娟，黄云霞，蒙玉娜，马淑萍，李红玲

1.宁夏医科大学临床医学院,宁夏银川 750000；2.甘肃省人民医院肿瘤内科，甘肃兰州 730000

弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是成人淋巴瘤中最常见的组织亚型，占成人非霍奇金淋巴瘤的25%～35%[1]，具有高度异质性，可原发也可由惰性B细胞淋巴瘤转化而来。在过去20年中，R-CHOP方案成为治疗DLBCL的标准方案，患者治愈率为50%～70%，但复发和难治病例仍然高达40%[2]，因此，寻找新的标志物对于DLBCL的诊疗具有重要的临床意义。

刺猬(HH)信号通路最早在果蝇中被发现，目前研究表明，HH信号通路不仅对胚胎发育至关重要，并且对成年生物体的组织和器官稳态起关键作用，该通路的激活可影响与增殖、血管生成及干细胞自我更新相关的靶基因的表达[3]。近年来研究发现，HH信号通路的异常激活可通过促进肿瘤细胞的增殖、存活、转移，血管生成，遗传不稳定性和肿瘤干细胞的自我更新等方式参与肿瘤的发生、发展[4]。音猬因子(Shh)、平滑受体蛋白(Smo)及神经胶质瘤相关癌基因同源蛋白1(Gli1)作为这条信号通路的关键蛋白因子，其异常表达与多种肿瘤的发生、发展密切相关。本研究通过免疫组织化学SP法检测Shh、Smo、Gli1在DLBCL组织中的表达情况，探讨Shh、Smo、Gli1表达与DLBCL临床病理参数的关系，以期为DLBCL的诊疗提供新思路。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集甘肃省人民医院2016年1月至2020年12月首次经病理学确诊的DLBCL患者石蜡包埋组织标本58例。其中来源于男性32例，女性26例；患者年龄15～83岁，中位年龄54岁。收集同期20例淋巴结反应性增生患者的淋巴组织作为对照。入选患者均未行抗肿瘤治疗，所有患者均以相应组织的病理活检结果为诊断依据，诊断参照《淋巴瘤病理诊断》[5]。本研究符合医学伦理学规范并获甘肃省人民医院伦理委员会批准。

1.2方法 从医院病历记录中收集患者以下临床资料：年龄、性别、An-Arbor临床分期、B症状、国际预后指数(IPI)评分、骨髓侵犯情况，以及乳酸脱氢酶(LDH)、β2微球蛋白(β2-MG)、C反应蛋白(CRP)水平。入选患者的淋巴组织标本使用10%甲醛固定，常规石蜡包埋并连续切片，厚度为4 μm，使用免疫组织化学SP法检测DLBCL组织及淋巴结反应性增生组织中Shh、Smo、Gli1的表达水平。兔抗人Shh多克隆抗体、兔抗人Smo多克隆抗体购自英国Abcam公司，兔抗人Gli1多克隆抗体购自GeneTex公司。检测过程按照试剂盒说明书进行操作，Shh、Smo、Gli1试剂工作浓度均为1∶200，一抗对照使用磷酸盐缓冲液(PBS)。

1.3判断标准 镜下观察制备好的切片，采用半定量积分法：根据着色强度和着色细胞所占百分比综合判断。分别对Shh、Smo、Gli1阳性细胞数和染色强度两个变量进行评分，以细胞膜或细胞质出现棕黄色颗粒为阳性染色，采用阳性细胞百分比与染色强度之积对结果进行判定。阳性细胞的评分如下：0～5%计0分，>5%～25%计1分，>25%～50%计2分，>50%～75%计3分，>75%～100%计4分。染色强度评分如下：未染色者为阴性，计0分；淡黄色者为弱染色，计1分；棕黄色者为中度染色，计2分；棕褐色者为强染色，计3分。将上述两项评分结果相乘：0分为阴性；1～12分为阳性，其中1～4分(+，弱阳性)，5～8分(++，中度阳性)，9～12分(+++，强阳性)。以上步骤均由两位具有丰富临床经验的病理科医师采用双盲法阅片。

1.4统计学处理 使用SPSS22.0统计软件对数据进行统计分析。计数资料以例数或率表示，组间比较采用χ2检验；等级变量之间的相关性采用Spearman相关进行分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1Shh、Smo、Gli1在DLBCL组织及淋巴结反应性增生组织中的表达 Shh在58例DLBCL组织中的阳性率为34.5%(20/58)，而在20例淋巴结反应性增生组织中的阳性率为5.0%(1/20)，差异有统计学意义(χ2=5.194，P<0.05)。DLBCL组织中Smo阳性率为41.4%(24/58)，明显高于淋巴结反应性增生组织的5.0%(1/20)，差异有统计学意义(χ2=7.145，P<0.05)。Gli1在DLBCL组织中的阳性率为29.3%(17/58)，在淋巴结反应性增生组织中未见阳性表达，差异有统计学意义(χ2=6.307，P<0.05)。见图1。

2.2Shh、Smo、Gli1表达与DLBCL患者临床病理参数间的关系 Shh、Smo、Gli1的表达均与DLBCL患者的Ann-Arbor临床分期有关(P<0.05)，且分期越晚(Ⅲ+Ⅳ期)，Shh、Smo、Gli1的阳性率越高。Shh的表达还与IPI评分有关(P<0.05)，Smo的表达还与骨髓侵犯有关(P<0.05)，而Gli1的表达还与IPI评分、B症状有关(P<0.05)。但三者与患者的年龄、性别，以及LDH、β2-MG、CRP水平无关(P>0.05)。见表1。

表1 Shh、Smo、Gli1表达与DLBCL患者临床病理参数间的关系(n)

2.3Shh、Smo、Gli1在DLBCL组织中表达的相关性 经Spearman相关分析，Shh与Smo的表达呈正相关(r=0.571，P<0.01)，Shh与Gli1的表达呈正相关(r=0.678，P<0.01)，Smo与Gli1的表达呈正相关(r=0.662，P<0.01)。见表2～4。

表2 Shh与Smo在DLBCL组织中的表达情况(n)

表3 Shh与Gli1在DLBCL组织中的表达情况(n)

表4 Smo、Gli1在DLBCL组织中的表达情况(n)

3 讨 论

多项研究表明，HH信号通路在多种肿瘤的发生、发展中存在异常激活[6-7]。在该通路中，目前研究最为深入的是Shh配体，其活性最高，并参与胚胎发育过程中各器官的发育。Shh配体已被证明通过调节癌细胞的增殖、恶性肿瘤转移和肿瘤干细胞的扩张来驱动癌症的进展。Smo是HH信号通路中的一个辅助受体，它在结构上类似于G蛋白偶联受体，被认为是一种积极的HH信号通路调节因子。Gli1作为该通路的最终靶标，为HH信号通路提供正反馈。HH信号通路在肿瘤中的异常激活存在多种方式，包括依赖配体的激活及非依赖配体的激活，其中依赖配体的激活还包括自分泌、旁分泌机制和反向旁分泌机制[8]。有研究报道，在基底细胞癌患者中经常出现表达Smo的体细胞突变，这是通过非依赖配体的方式激活HH信号通路[9]，在髓母细胞瘤(MB)中也存在同样的方式，TAN等[10]由此分析了38例MB的Shh亚型(Shh-MB)患者的数据，结果显示80%的Smo突变优先在小脑半球中形成，在成人肿瘤中Smo突变率更高，从而推测成人Shh-MB的突变似乎会影响肿瘤的定位。

目前关于HH信号通路在DLBCL中的作用研究甚少，故本研究通过免疫组织化学SP法检测了DLBCL组织中Shh、Smo、Gli1的表达情况。结果表明，Shh、Smo、Gli1在DLBCL组织中的表达明显高于淋巴结反应性增生组织，Shh、Smo、Gli1的表达均与Ann-Arbor临床分期有关(P<0.05)，这表明以Shh为配体的HH信号通路可能在DLBCL的疾病进展中发挥重要作用。Shh的表达还与IPI评分有关(P<0.05)，而Smo的表达还与骨髓侵犯有关(P<0.05)，Gli1的表达与IPI评分、B症状有关(P<0.05)。有报道称，Shh和Gli1为接受治疗性手术的胰腺癌患者提供了重要和独立的预后信息，肿瘤细胞低水平表达Gli1或Shh与较长的无病生存期和总生存期有关，Gli1和Shh是潜在的生物预后标志物[11]。总之，HH信号通路可能参与了DLBCL细胞的增殖并促进肿瘤的转移。

近年来以HH信号通路关键蛋白为作用靶点的抗肿瘤药物研究也是一大热点，ALAM等[12]研究表明，运用Shh抑制剂环巴胺可以抑制大鼠肿瘤血管内皮细胞增殖和迁移，减缓肿瘤的增殖和侵袭。针对Smo基因位点的抑制剂，通过抑制Smo活性可直接阻断Gli1转录因子的激活，抑制下游基因的表达。目前维莫德吉和索尼吉布已被美国食品药品监督管理局(FDA)批准上市用于治疗基底细胞癌[13-14]，但是随着获得性耐药的出现也限制了Smo抑制剂的长期疗效[15]。目前针对Gli1基因的靶向抑制剂有GANT61、ATO、格拉斯吉布和GANT58等，格拉斯吉布和小剂量阿糖胞苷联用也被美国FDA批准用于治疗急性粒细胞白血病[16]。这为使用HH信号通路抑制剂联合其他药物治疗恶性肿瘤提供了一个新的思路。

本研究结果显示，在DLBCL组织中存在HH信号通路的过度激活，并参与了DLBCL的发生、发展，这表明Shh配体介导的HH信号通路的过度激活在DLBCL的疾病进展中发挥独特的作用。但由于纳入样本量有限，时间跨度较大，可能造成选择性偏倚，导致统计结果出现差异。并且目前部分样本的随访时间较短，因此,三者是否与DLBCL患者的生存期及预后有关仍需要进一步验证并随访。

综上所述，本研究的结果显示Shh、Smo、Gli1在DLBCL中过表达，表明HH信号通路与DLBCL发生、发展密切相关，有望为DLBCL的治疗提供新的思路。关于HH信号通路在DLBCL发生、发展中的具体机制及与预后的相关性目前仍有待进一步的研究。