PCR技术在食品微生物检测中的作用分析

孟庆辉 唐桂华

食品安全是社会大众关注的热点问题，也是世界公认的解决难度最大的公共卫生问题。近年来，随着经济水平大幅度提升，人民的物质生活和以往相比得到大幅度改善，对食品安全也提出了更高的要求，如何提升食品微生物检测成效和质量已成为当前食品安全工作发展的趋势。常见致病菌包括副溶血性孤菌和沙门氏菌等，高效检测上述致病菌能切实保障食品安全。但做好上述工作需要成熟的检测技术。PCR（聚合酶链式反应）以操作便利、快速以及灵敏等优势在食品微生物检测中得到广泛应用，该技术还可鉴定细菌抗原结构，以及检测原理明确食品微生物情况。本文基于PCR技术分析其微生物检测具体应用，望给予食品检测人员以及相关研究者提供参考。

一、PCR概述

（一）基本原理

PCR是一种具有选择特性的且在体外对DNA或RNA片段扩增方式，其反应原理基本类似于细胞内DNA复制。然而PCR反应体系相较于细胞内的DNA复制更为简单，主要涵盖四种dNTP、缓冲液体系、耐热DNA聚合酶、DNA靶序列及其DNA靶序列单链3末端行互补的合成引物。PCR由低温退火、高温变性、适温延伸三个反复热循环步骤组成。其中低温退火即模板DAN会通过变性分解至两条单链，该单链经引物退火、降低温度以及与互补DNA模板相结合后形成局部双链，由此形成DNA复制起点。高温变性即在95℃的高温环境中，双链DNA模板造成氢链断裂，进而分离双链后形成单链DNA，也称之为变性。经变性的单链可在此结合且能同时恢复性质。适温延伸即当模板与引物相结合后受DNA多聚酶作用影响，从引物5端延伸至3端，与模板互补的DNA链由此合成，DNA含量经上述循环后增加1倍。

（二）基本成分

PCR反应的主要成分有以下组成：核苷酸引物（一对）、模板DNA、三磷酸脱氧核苷酸（四种）、耐热DNA聚合酶、缓冲液、部分离子。其中模板即需扩增序列的核苷酸，PCR反应模板可由所有形式的RNA与DNA组成。引物即将靶DNA3端与5端异性相结合的核苷酸片段，PCR特异性由上述片段决定。缓冲液即维持PCR反应pH，广泛应用的Tris-HCl在10-50mol/L范围内，pH变化在PCR反应中的6.8-7.8。耐热DNA聚合酶即保证PCR自动化实现，该物质可承受95℃以上高温且不会丧失原有活性。三磷酸脱氧核苷酸，即PCR反应原料为dGTP、dTTP、dATP、dCTP三磷酸脱氧核苷酸。除dNTP溶液pH为7.0外，其他dNTP浓度均在2.5mmol/L间，通常使用浓度控制在20-200umo/L，为降低错配发生率，需保证各个dNTP分子浓度相等。

（三）反应系统组成

PCR反应系统由TaqDNA聚合酶的量、PCR缓冲液、石蜡油、模板以及四种脱氧三磷核苷酸组成。

（四）优势

1.操作便捷简单

以往在检测食品微生物时多以自动化检测技术为主，经长期实践发现，传统检测技术检测时间长，整体检测准确性与检测效率偏低，工作人员任务繁重。PCR检测技术是科学技术发展中延伸而出的高自动化检测技术，运用PCR技术和相应的检测程序即可检测食品多种微生物，一人可独立完成检测工作，操作简单且系统自动化程度高，最重要的是检测时效性佳、效率高，为食品卫生安全提供基本技术支持的同时，推动了食品微生物检测工作的迅速发展。

2.检测效率高

以往食品微生物检测花费的检测周期为2-4d，若检测种类较多则需7d完成。再加上大部分食品为保质期较短的即食性食物，部分商家未等到食品微生物检测结果就直接销售，造成食品微生物检测滞后现象严重。若发现食品卫生安全问题则会召回已销售食品，在此过程中极有可能发生食品安全事故，造成不可预估的经济和品牌口碑损失。PCR检测效率高，通常只需数小时就可完成对食品微生物的检测，结果出示时间为1d左右。

3.检测准确率高

由于分离培养、生化鉴定等传统检测方式在检测食品微生物时面临的困难较多，进而降低检测准确率，不利于对食品微生物种类及其产生的危害性进行准确辨别。PCR技术在现代食品微生物检测中发挥着不可小觑的作用，该技术可同时对多种食品微生物进行检测，且能运用先进的PCR技术准确辨别微生物种类及其危害性，保证食品卫生安全的同时，使食品微生物检测准确率得到大幅度提升。

（五）影响因素

影响PCR的因素共有以下几个方面：①引物设计。通常需运用统计学计算引物长度，要求引物组成与CG%含量比例平均，尽可能防止引物内部形成显著次级结构。②温度循环参数。参数由循环次数、引物退火温度、引物延伸温度以及模板变性温度等组成。③扩增平坡。当扩增历经相应的循环周期后，需扩增片段则进入平坡循环次数，并非根据不断增多的随指数进入平坡，上述现象与已有的模板拷贝数与合成DNA总量有关。所谓平坡即PCR循环后期，当合成产物达至0.3-1pmol时，原有基于指数增加的速率会因堆积的产物变成平坦。導致PCR进入平坡因素多以已消耗完毕的引物与dNTP及Taq酶失去活性等有关。④PCR特异性。缓冲液浓度改变、酶与引物浓度降低、简短退火与退火温度时间及避免模板已有的次级结构等。⑤DNA聚合酶选用。第二段耐热DNA聚合酶Stoffel片段、RTth逆转录酶、TaqDNA聚合酶等。

二、PCR技术在具体应用中的测定方式

PCR技术因自身表现优异，进而广泛应用于现代食品检测工作。例如，食品检测中常见的大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌均能经PCR技术检测。例如，金黄色葡萄球菌会迅速在蔬菜和水果中繁殖，若长期存放蔬菜水果则会导致大量繁殖的金黄色葡萄球菌出现在果蔬表面。金黄色葡萄球菌的代谢产物肠毒素会严重损伤人体，若情况严重则会导致食用者中毒，故而在检查食品时需科学检查类似菌，消除细菌对人体造成的危害。PCR技术可检测食物样品微量元素与相关物质且具有较高的检测精度。食品生产企业在食品出厂前运用PCR技术检验可有效避免市场流入非合格食品。在检测过程中通过标记特定蛋白以及检测蛋白，获取检测微生物含量。当前在食品微生物检测中广泛应用PCR技术，可有效检测不同的被检测菌，大幅度提升检测准确率。

（一）常规PCR检测法

食品微生物的常用检测方式即常规PCR检测法，即将测定目标物质中的DNA模板和及其反应产生的引物相混合。在检测中将一定量的聚合酶加入混合后的混合物中，就可制作基本检测样本。在后续检测中还需在特定反应条件与温度下开展培养反应活动。添加聚合酶的混合物在适合温度环境下受聚合酶作用影响，引领目标物质行电脑模板序列下扩增，模板DNA片段经多个周期后会持续进行复制与扩增。与此同时，在检测中，测定目标物上所具有的DNA能直接反映被检测食品在相应时间中形成的微生物数量与种类。以往检测方式即通过DNA复制与扩增能力将少量且潜在微生物群转至可观性较强的微生物群，达到检测食品微生物的目的。

（二）多重PCR检测法

多重PCR检测法是对常规PCR检测法的调整与创新。如果说常规PCR技术在检测中运用单引物，那么多重PCR检测技术则运用多个DNA引物检测。例如，将两个或两个以上反应引物添加至同一PCR反应体系，上述引物需在聚合酶作用下持续复制与扩增。由于在反应前添加多个DNA引物，经聚合酶反应后可获取多个不同的DNA反应片段，故而多重PCR检测方式可测定分析微生物的多个致病菌，使检测效率与准确率得到大幅度提升。多重PCR检测技术与传统PCR检测法相比可分析出更多的致病因子，防止在检测中发生遗漏被检测菌现象，使检测更为严谨。对此，在食品微生物检测中，除检测特殊致病菌外，运用多重PCR检测法可检测食品微生物，避免发生遗漏检测内容，缩短检测时间，减少工作人员负担，切实提升食品微生物的检测准确率。此外，多重PCR检测法投入的样本相对较少，经济效益高，可检测多个基因。

（三） PR-PCR检测法

PR-PCR检测是常规PCR检测法的变形形式，虽不同于常规检测法，然而该检测技术在检测食品微生物中有显著优势。该检测技术原理，即提取细胞或组织中的总RNA并以mRNA作为模板，运用随机引物或01igo和逆转录酶反转录形成cDNA。同时，基于cDNA模板行PCR扩增，由此获取检测基因或目的基因表达。与常规PCR检测方式相比，PR-PCR检测对检测目标物中的一条RNA行逆转录，之后就会产生互补DNA并基于此行复制与扩增。应用该检测技术需明确的是，逆转录DNA模板处于完整状态且不含任何蛋白质或杂质，保证基因链完整。在检测食品微生物时可应用于微生物检测定量分析，如将数字技术与荧光技术相结合的PCR检测，通过定量分析测定目标中的微生物后再行检测，可有效保证检测中高灵敏性，更能获得准确检测结果。所以，运用PR-PCR检测法检测食品微生物可针对性地对微生物进行检测，保证高精准度的检测结果。

三、PCR技术在食品微生物检测中的应用

（一）应用PCR技术检测海产品中的副溶血性弧菌

海产品中常见的细菌种类即副溶血性弧菌，人类一旦食用含有副溶血性弧菌的海产品则会引发急性肠胃炎，所以副溶血性弧菌是最为重要的食源性疾病病原菌类型。相关研究指出，副溶血性弧菌在沿海国家与地区的海产品中具有相对严重的污染率，其中软体类、甲壳类、贝类、鱼类等海产品有着较高的检出率，受污染程度与海域环境条件、海产品类别等有着紧密联系。綜观近年来的检测结果得知，淡水产品发生副溶血性弧菌的概率呈显著上升趋势，且具有季节性、多环节与多物种等高污染特征。当前检测食品中副溶血性弧菌多采取快速检测法与传统检测法，使用率最高的则为传统副溶血性弧菌检测法，因检测便利且价格低廉受到欢迎，然而该检测方式灵敏度低且耗费大量时间。随着科学技术的快速发展，针对食品中的副溶血性弧菌检测也有所创新，很多科技企业相继推出如PCR-探针法（副溶血性弧菌核酸检测试剂盒）等特异性强、便利且迅速的检测方式，对提升检测效率和质量方面有着重要现实意义。相关研究文献指出，目前有22种快速检测食品中的副溶血性弧菌方式，如基于分子生物学的PCR-变性高效液相色谱法、基于细菌培养与生化鉴定的显色培养激法、基于噬菌体特异性的噬菌体鉴定技术、基于免疫学为基础的免疫胶体金技术法、基于信号转换与生物识别的生物传感器技术、基于单克隆抗体与细胞分子水平的流式细胞术。

（二）应用PCR技术检测生鲜食品食源性病原微生物

所谓生鲜食品即尚未对食物进行加工或初步简单加工即可食用的食品，如果蔬、肉制品、水产品等。运用多重PCR技术检测生鲜食品可有效改变传统检测技术存在的不足。一般多重PCR技术针对不同类型病原微生物的特异性与明暗性较高，且在检验非活菌时展现的检测效果更为显著，避免出现假阴性结果。相关研究者运用多重PCR技术可在4h内检测近6种食源性病原微生物。相关研究者所研究的巢式PCR检测引物灵敏度高出常规PCR检测灵敏度近1万倍，提示在检测生鲜食品食源性病原微生物中应用多重PCR技术效果显著。

（三）应用PCR技术检测大肠杆菌

大肠杆菌也称为大肠埃希氏菌，该病菌在一定条件下可引起多种动物与人发生尿道、胃肠道等多种局部组织器官感染。大肠杆菌属于寄居在动物肠道中的病菌，有一小部分受相应条件影响而引发疾病。与此同时，大肠杆菌的血清型会引发动物或人体肠道感染，多由特定的致病性毒素与菌毛抗原等感染引发。除典型的肠道感染，还会引发脑膜炎、关节炎、尿道感染以及败血型感染等疾病。当前人类广泛关注对食品中的大肠杆菌的快速准确检测，常用滤膜法、发酵法、平板计数法、ATP生物发光法、自动化仪器检测法等，由于大肠杆菌具有毒性且具有一致性，部分检测方式在准确率方面存在不足。在微生物检测中应用PCR技术则为检测大肠杆菌中的DNA双链，经PCR技术于免疫磁分离技术相结合使大肠杆菌的检测准确率得到大幅度提升，对保障食品安全有着重要现实意义。

（四）应用PCR技术检测乳制品沙门氏菌

乳制品质量把控是食品安全管理的重要组成部分，若在生产乳制品中未合理应用生产环境控制技术，则会导致乳制品中寄存具有感染性质的病原微生物。常规乳制品检测方式为培养微生物后运用生化反应检测，但整体检测速度慢且准确率偏低。运用PCR技术检测乳制品中的沙门氏菌可使特定目标物片段得到扩增，再经Mg2+催化TaqDNA聚合酶，提升其活化性能，达到片段扩增目的。相关研究者指出，运用基于免疫磁珠技术于PCR检测技术的PCR检测+磁珠富集检测乳制品沙门氏菌准确率高，操作便利，更为解决食品检测前的时间缩短问题提供了解决路径。相关学者在监测复合调味料沙门氏菌中根据国际标准检测法增加细菌再行涂布XLD与BS平板，基于沙门氏菌特定序列设计相关引物，筛选出疑似菌落后测试菌液PCR反应，不仅缩短了检测沙门菌的时间，更大幅度提升了检测准确率和效率。

结语

总之，食品安全是重要的民生问题，虽然相关部门加大了对食品安全管理的力度，然而，群体性食品安全事件仍时有发生。借助现代技术可使食品微生物检测效率与准确率得到大幅度提升，迅速判断食品问题原因，为高效解决食品安全事件奠定基础。本文研究分析的PCR技术在食品微生物检测中以便利、高效等优势得到青睐。在未来发展中，PCR技术会逐渐普及并广泛应用于食品微生物检测，并与现代科学技术热点之一的数学技术相结合，进一步提升食品检测质量，保障食品安全，推动食品检测的高效有序发展。