t检验和HorRat方程在方法验证中的应用

朱东波 吴雄杰项 杨 吴先锋 高 江 姚 成

安徽省包装印刷产品质量监督检验中心 国家高分子材料质量检验检测中心（安徽）（安徽桐城 231400）

CNAS CL01-2018（ISO/IEC17025:2017）《检测和校准实验室能力认可准则》和RB/T 214—2017《检验检测机构资质认定能力评价 检验检测机构通用要求》中，明文规定了实验室在引入方法前，应验证能够正确地应用该方法，以确保实现所需的方法性能，并应保存验证记录。如果方法标准发布机构修订了方法，应在所需的程度上重新进行验证[1-2]。可见，方法验证在今后检验检测实验室的资质能力认可/评价中日益重要。GB/T 27417—2017《合格评定化学分析方法确认和验证指南》定义了方法验证，即实验室通过试验，提供客观有效证据，证明满足检测方法规定的要求；对于定量分析的方法验证过程中的关键参数，至少应测定正确度和精密度[3]。正确度是指测量结果的正确度用于表述无穷多次重复性测定结果的平均值与参考值之间的接近程度[3]。

在方法验证过程中，常常通过测量参考物质或标准物质来获取正确度的信息。此外，也可通过加标回收试验，利用回收率验证方法的正确度。回收率越低，偏倚对方法的影响越大，正确度就越低。但是，大多数检测项目没有参考或标准物质，这种情况下，实验室只能依赖于统计学评价（t-检验和F-检验）对分析方法的偏倚显著性进行评估。精密度是指在规定条件下，对同一或类似被测对象重复测量所得示值的一致程度[3]。精密度仅依赖于随机误差的分布，与真值或参考值无关。测定精密度取决于规定的测量条件，重复性和再现性条件是测量条件的两个极端情况，因此精密度通常可分为重现性精密度和再现性精密度。精密度通常有3种方式表示：用标准偏差和变异系数进行评价；通过方法比对评价重复性/再现性或重复性限/再现性限；当方法标准中没有给出精密度或没有比对方法时，实验室可以通过采用Horwitz方程和HorRat方程计算的结果来评价精密度。

本研究以SH/T 1591—1994《乙烯-乙酸乙烯酯共聚物（E-VAC）中乙酸乙烯酯含量测定方法》的方法验证为例，对方法的正确度和精密度进行数据分析及评价，利用t检验和HorRat方程建立相应的方法验证评价方法。

1 实验方法

按照SH/T 1591—1994要求，根据乙酸乙烯酯含量称取m（g）样品置于250 mL锥形瓶中，加50 mL二甲苯和25 mL氢氧化钾-乙醇，将锥形瓶转入回流冷凝器上，加热至200℃并保持2 h，取下冷却至室温，加入25 mL 6 g/L硫酸溶液，加入酚酞溶液，用浓度为c（mol/L）的氢氧化钠溶液进行滴定，记录滴定消耗体积V1（mL），同时做空白试验，记录滴定消耗体积V2（mL）。根据公式wVAC( )=其中0.086 09表示与1.0 mL氢氧化钠标准溶液[c( N aOH)=1.000 mol/L]反应的乙酸乙烯酯的质量（g），计算乙酸乙烯酯的检验结果。

2 结果与分析

2.1 正确度

在无法获取参考或标准物质时，采用比对试验进行正确度分析；当每组检测的平行次数为n（n≥6）时，可先对两组数据进行F检验，分析是否有显著性差异，若无显著性差异，再按照t-检验对试验结果进行分析，若结果小于t临界值，可认为测定结果与标准值之间无显著性差异[4]。

两位试验人员在同一环境中，使用相同的试剂、标准溶液以及同一滴定管，在规定的时间内，各自连续测定8次，结果如表1所示。

表1 两组实验结果%

依据GB/T 4883—2008《数据的统计处理和解释正态样本离群值的判断和处理》要求，对两组实验结果是否有离群值或异常值进行判断和处理，运用格拉布斯（Grubbs）检验法对检验结果进行显著性偏差分析，取置信概率为95%，即α=0.05。

当Gn＞G1-α(n)时，判定xn为离群值，否则判未发现xn是离群值。格布拉斯公式：Gn=xn-ˉ( )s；其中和s分别为样品均值和样品标准偏差。查格布拉斯临界值表可知G0.95(8)=2.032。

按升序顺序对人员1的检验结果进行排序：6.03，6.15，6.19，6.23，6.32，6.45，6.57，6.61，样本量平均值=6.32，样品标准偏差s=0.21，则G(8)=1.381＜G0.95(8)=2.032。G(1)=1.381＜G0.95(8)=2.032。因此，未发现x(8)=6.03和x(1)=6.61是统计离群值，即该组检测结果无离群值。

按升序顺序对人员2的检验结果进行排序：6.21，6.30，6.34，6.53，6.61，6.66，6.68，6.84，样本量平均值=6.52，s=0.22，G(8)=1.454＜G0.95(8)=2.032，G(1)=1.409＜G0.95(8)=2.032。因此未发现x(8)=6.84和x(1)=6.21是统计离群值，即该组检测结果无离群值。

两组检测结果均无离群值，可进行下一步分析。

2.1.1 F检验

2.1.2 t检验

取置信区间p=0.95，α=0.05，查t分布表可知，tα,n1+n2-2=t0.05,14=2.14。t=1.88＜t0.05,14，可认为测量结果与标准值之间无显著性差异，比对试验结果满意。

由上述统计学评价结果可知，其正确性满足标准要求。

2.2 精密度

精密度包括重复性和再现性。根据食品法典委员会《微量元素标准化的转化方法》和欧盟Commission Regulation（EC）No337/2007报告，采用Horwitz方程和HorRat方程来判断精密度是否接受[5-6]。重复性值和再现性值分别为HorRatr和HorRatR，要求HorRat值小于2。再现性相对标准偏差期望值为RSDoR，重复性相对标准偏差期望值为0.66RSDoR。

式中：w为质量分数，RSDoR为期望相对标准偏差，RSDR为实际相对标准偏差；

2.2.1 不同人员进行VAC含量的再现性实验，进行精密度分析

两组检验结果的平均值：

2.2.2 对人员1测量结果进行重复性精密度分析

由HorRat的结果可知，其精密度满足要求。

3 结语

两组实验人员采用同一检测方法，使用同一试剂及仪器进行检测，两组结果与标准值无显著差异，即正确度符合要求；精密度的重复性和再现性实际标准偏差均小于标准偏差期望值，精密度符合要求。可知，大多数没有参考或标准物质的检测项目，通过t检验和HorRat方程进行分析方法验证确实可行，也为实验室依照CNAS CL01-2018制定方法确认和验证程序文件及作业指导书提供了参考。