贝母素甲影响肝癌细胞生物学行为研究

陈万松，熊 伟，熊 书

(重庆三峡医药高等专科学校基础医学部，重庆 404120)

肝癌是一种发生于肝脏的恶性肿瘤，具有极高的死亡率。目前，治疗肝癌主要有手术治疗、化疗、放疗、中药治疗和生物治疗等方法，其中手术治疗、放疗、化疗效果远远不尽人意。中药治疗可以改善患者体征，减轻放化疗的毒副作用，提高生存率和生存质量。贝母是贝母属植物的鳞茎，干燥入药，是川产道地贵细药材之一，因其独特的化痰止咳、清热润肺和散结消痈效果而驰名。贝母的主要活性单体为皂苷、糖苷、甾体生物碱和萜类等[1]。现代药理研究显示，贝母中的生物碱贝母素甲具有抗肿瘤活性，可抑制多种肿瘤细胞的生长[2-3]。综合结果表明，贝母素甲可作为一种全新的抗癌候选药物，但是贝母素甲对肝癌细胞的抑制活性尚未见报道。通过研究贝母中贝母素甲抑制肝癌细胞的增殖、生长及相关机制，以期为后续应用于临床提供可靠的药理依据。

1 材料与方法

1.1 材料

A组：含1 μmol/L贝母素甲的培养基；B组：含2.5 μmol/L贝母素甲的培养基；C组：含5 μmol/L贝母素甲的培养基；D组：含7.5 μmol/L贝母素甲的培养基；E组：含10 μmol/L贝母素甲的培养基。

1.2 仪器

CO2培养箱(德国Heraeus公司生产)；倒置荧光显微镜(日本Olympus公司生产)；多孔酶标仪(美国Bio-RAD公司生产)；流式细胞仪(美国B D公司生产)。

1.3 实验方法

1.3.1 MTT法评价贝母素甲对肝癌HepG 2细胞增殖的影响

96孔板培养HepG 2细胞24 h后去培养基，A、B、C、D和E组每孔分别加入含不同浓度的贝母素甲培养基100 μL，对照组每孔加入不含贝母素甲的培养基100 μL，空白组每孔只加不含细胞与贝母素甲的培养基100 μL，每个组设8个复孔。接种完毕后，分别培养24 h、48 h和72 h，弃上清，每孔再加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，37℃、5% CO2孵育4 h。每孔再加入三联液100 μL，37℃混匀后过夜放置。将蓝紫色产物formazan溶解，酶标仪570 nm测定吸光度值。

1.3.2 贝母素甲对肝癌HepG 2细胞周期的影响

将对数生长期的HepG 2细胞贴壁生长至70%融合，置于无血清的RPMI-1640培养基中饥饿培养4 h，再分别加入含1 μmol/L、2.5 μmol/L、5 μmol/L、7.5 μmol/L和10 μmol/L的贝母素甲培养基处理72 h，以未加药物处理的组为对照组。HepG 2细胞离心后，70%乙醇固定杀死细胞，4℃下放置4 h，加入RNaseA去除RNA，37℃水浴30 min，加入800 μL PI染色液，流式细胞仪488 nm波长检测。

1.3.3 贝母素甲对肝癌HepG 2细胞凋亡的影响

将对数生长期的HepG 2细胞贴壁生长至70%融合，更换无血清的RPMI-1640培养基饥饿培养4 h，再分别加入含1 μmol/L、2.5 μmol/L、5 μmol/L、7.5 μmol/L和10 μmol/L的贝母素甲培养基处理72 h，以未加药物处理的组为对照组。根据Annexin V-PI 凋亡试剂盒操作，流式细胞仪检测。

2 实验结果

2.1 体外MTT法评价贝母素甲对肝癌细胞HepG 2增殖的影响

贝母素甲对HepG 2细胞的影响见表1。结果显示：药物刺激后，C、D和E组与对照组相比有明显差异；随着贝母素甲浓度的增大，其对细胞的抑制作用逐渐加强，提示高浓度的贝母素甲对HepG 2细胞有一定的毒性作用。除此之外，药物处理时间越长，对肝癌细胞的影响越大。

表1 不同浓度贝母素甲对肝癌HepG 2细胞增殖的影响Tab.1 Effects of different concentrations of Peimine on proliferation of hepatocellular carcinoma HepG 2 cells

2.2 贝母素甲对肝癌HepG 2细胞周期的影响

经过定量分析的结果显示，1 μmol/L、2.5 μmol/L、5 μmol/L贝母素甲3个处理组细胞周期分布与对照组相比，G0G1期与S期均没有明显改变(P>0.05)，7.5 μmol/L和10 μmol/L贝母素甲处理组细胞G0G1期占比显著多于对照组(60.83±3.50%，63.53±2.43% vs 49.86±3.50%，P<0.05)而7.5 μmol/L和10 μmol/L贝母素甲处理组处于S期的占比显著少于对照组(表2)。表明≥7.5 μmol/L贝母素甲处理HepG 2细胞使G0G1占比增加，表明细胞被阻滞在G0G1期，进而使细胞的分裂被阻止。

2.3 贝母素甲对肝癌HepG 2细胞凋亡的影响

早期凋亡分析发现，5 μmol/L、7.5 μmol/L和10 μmol/L贝母素甲早期凋亡百分比依次增大。晚期凋亡分析表明，对照组、2.5 μmol/L、5 μmol/L、7.5 μmol/L和10 μmol/L贝母素甲组晚期凋亡百分比依次增大，从2.5 μmol/L贝母素甲组开始后的4组早期凋亡百分比均与1 μmol/L贝母素甲和对照组有显著性差异，说明贝母素甲浓度的增大会增加细胞的早期凋亡(表3)。晚期凋亡中，7.5 μmol/L和10 μmol/L贝母素甲与前面几组有显著性差异，说明≥10 μmol/L贝母素甲出现较强的毒性，诱导细胞发生凋亡和坏死。

表2 不同浓度贝母素甲对肝癌HepG 2细胞周期的影响Tab.2 Effects of different concentrations of Peimine on cycle of hepatocellular carcinoma HepG 2 cells

表3 不同浓度贝母素甲对肝癌HepG 2细胞凋亡的影响Tab.3 Effects of different concentrations of Peimine on apoptosis of hepatocellular carcinoma HepG 2 cells

3 讨论

1983年，Mosmann创立了MTT比色法并第一次应用IL-2等细胞因子处理大鼠淋巴细胞瘤细胞并研究对其增殖的影响[4]，随后迅速推广，广泛用于细胞实验[5]。贝母素甲是一种生物碱，对肺癌细胞有所抑制，但是对于肝癌细胞暂未有所记载。研究贝母素甲对HepG 2细胞增殖的影响，不仅能为临床上温和的方式治疗肝癌有所帮助和补充，还能够为研究其对HepG 2细胞周期、凋亡、迁移等方面作浓度参考。实验发现，高浓度的贝母素甲对HepG 2细胞有一定的毒性作用。

G0/G1期是细胞分裂的重要时期，当G0/G1期细胞占比降低，则处于细胞分裂期的细胞降低，从而引起S期和G2/M期细胞的数量降低，导致细胞周期阻滞或延长，DNA合成不足，影响细胞代谢、生长、增殖等，最终诱发凋亡机制，导致细胞凋亡。结果表明，贝母素甲使HepG 2细胞周期阻滞在G0G1期，从而阻止细胞分裂。

Annexin V/PI双染法是一种常见的细胞凋亡荧光检测方法。Annexin V与磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)有较强的亲和力，但PS存在于细胞膜内侧，只有在细胞发生早期凋亡时才会翻转到外侧，Annexin V能与外翻的PS结合[6]。碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)是一种核酸染料，只有在细胞凋亡晚期和细胞坏死时才能进入细胞，使细胞核染色。Annexin V是早期反应而PI 是晚期反应，因此两者结合使用可区分不同时期的凋亡现象。结果表明，贝母素甲诱导HepG 2细胞发生凋亡和坏死。