基于SSR 标记的广东栽培益智群体遗传多样性分析

刘朝玉, 林艳, 吴保欢, 羊海军, 李薇, 崔大方*

(1. 华南农业大学, a. 林学与风景园林学院; b. 基础实验与实践训练中心; c. 华南农业博物馆，广州 510462；2. 贵州省凯里市第一中学，贵州 凯里556000)

益智(Alpinia oxyphylla)为姜科(Zingiberaceae)山姜属多年生草本植物，为中国特有种[1]，主产于海南、广东、广西、福建和云南。作为传统中药材，益智以成熟果实入药，具暖肾固精、温脾止泻的功效，被誉为“四大南药”之一[2-3]。随着研究的深入，其新的药用价值还在陆续发现，例如抗肿瘤和治疗帕金森症[4-5]。20 世纪80 年代以来，国内外市场对益智仁的需求逐渐增加，货源已从野生资源采集转化为规模化半野生人工栽培，年交易量达1 700~3 500 t[6]。生产方式的改变，促进了益智种质资源的收集、保存、评价和利用，以及优良品种选育、种苗繁育和规范化栽培等方面的研究，不仅更好地满足消费需求，也保护了野生资源。

相对于化学成分、药理药效研究[7-8]，益智的种质资源评定、居群遗传多样性、优良品种选育等领域的研究尚处在初级阶段[9]。Wang 等[10]利用ISSR(inter-simple sequence repeat)分子标记技术, 认为益智野生居群具有较高的遗传多态性，建议通过禁止开发野生资源来保护该物种的栖息地，同时加强种质资源库的建设。王茂媛等[11]的田间观测表明，益智在花果形态方面存在极为丰富的多态性, 个体间差异明显，但株丛内具有较高的一致性，其中果序长度、果实大小和形态这3 个性状可作为鉴别益智种质资源及杂交育种评定的重要性状。形态变异是基因型与环境压力共同作用的结果，可在一定程度上反映生物遗传变异的程度，然而王祝年等[12]报道益智种质资源间基于ISSR 标记的聚类与基于表型性状的聚类结果不完全一致，一方面是表型性状不仅受遗传物质影响，也受海拔、经纬度、郁闭度等环境因子要素的影响[13]；另一方面，ISSR 具有通用随机引物特征从而导致物种特性不强。相对的，SSR (simple sequence repeat)是在复制或修复过程中DNA 滑动和错配或染色单体不均等交换的结果，具有较高的物种特异性，可用于鉴定杂合子和纯合子[10,14]。SSR 长度为100~200 bp。因微卫星中重复单位的数目有极高的变异现象，所表现出的变异现象为微卫星单位数目成整倍性变异或可能出现重复单位序列中的序列不完全一样，从而形成多态性位点。SSR 分子标记技术已成功应用于多种农林植物的遗传多样性分析、目标基因的标定和指纹图谱的构建等研究中[14-16]。

20 世纪70 年代开始，广东省从海南引种益智，至今种植面积已近4 000 hm2，其中茂名地区的信宜、高州最为集中连片[17-18]，由于益智良种选育工作严重滞后，以及农户分散经营的业态，导致目前广东省境内种植的益智种质十分混杂，形态变异多样，产量差异显著，抗逆性参差不齐[19-20]。本研究利用SSR 分子标记技术针对广东省益智栽培群体进行遗传多样性的分析研究，探讨其遗传多样性丰富度、遗传结构及类型的划分，为广东省栽培益智种质资源的保护育种及良种选育提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 样本采集

本试验益智(Alpinia oxyphylla)材料分别采自广东省茂名地区的信宜白石镇岳龙村、洪冠镇洪胜村，高州古丁镇大窝村和龙马村、深镇镇良坪村、新垌镇高良村以及阳江市阳春双滘镇榕木村。根据益智果和叶片的形态特征分类划分为10 个群体(Z1~Z8、DA 和YC)，共166 份材料(表1)。采集益智新鲜叶片，放入-80 ℃冰箱保存用于后续DNA 提取。

1.2 DNA 提取和测序

使用北京天根新型植物基因组DNA 提取试剂盒DP320 提取益智鲜叶片总DNA，经1%琼脂糖凝胶电泳和核酸浓度检测合格后稀释至50 ng/μL，用于后续基因组测序。

1.3 SSR 引物扩增

23 对SSR 引物来自于邹颖[21](表2)，经PCR 扩增选择具有稳定扩增和多态性良好的14 对引物(表3)。SSR 扩增反应体系总体积为10μL，包括2×TaqPCR Master Mix 5μL，模板DNA 1μL (50 ng/μL), 上游引物0.1μL (100 ng/μL)，下游引物0.4μL (100 ng/μL),带荧光的M13 引物0.4μL (100 ng/μL), ddH2O 3.1μL。扩增反应程序: 95 ℃预变性5 min；然后95 ℃变性45 s，52 ℃~62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35 个循环；最后72 ℃延伸20 min。

表2 SSR 引物序列Table 2 Sequence of SSR primers

表3 益智的遗传多样性Table 3 Genetic diversity of Alpinia oxyphylla

1.4 SSR 数据分析

SSR 数据采用PopGene (ver. 1.32)[22]进行遗传多样性统计，计算Shannon’s 信息指数(Shannon’s information index,I)、等位基因数(observed number of alleles,Na)、有效等位基因数(effective number of alleles,Ne)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、群体间基因流(Nm)和Nei’s 遗传距离[23]。

利用Arlequin (ver. 3.5.1)分析群体间和群体内差异，位点和群体间的遗传分化系数(Fst)，进行AMOVA 分子方差和显著性分析，参数“Number of permutations”设置为9 999，“Number of permutetions”设置为100，显著性水平设置为0.05[24]。利用Structure (ver. 2.3.4)软件对群体进行遗传结构分析,利用Structure Harvester 计算ΔK 值和LnP(D)值，计算群体最佳K 值[25]。采用R 软件(www.r-project.org/)中ape 包的pcoa 函数进行PCoA 主坐标分析，并绘制样本分布散点图。

2 结果和分析

2.1 遗传多样性分析

SSR位点多态性从表3 可见，14 对引物在166 份栽培益智种质中共检测出88 个等位基因，每对引物检测等位基因1.198~3.279 个，平均3.729 个;Shannon’s 信息指数为0.190~1.235；观测杂合度为0.090~0.696，平均0.448；期望杂合度为0.123~0.655,平均0.512。

群体遗传多样性比较采用PopGene 进行群体遗传多样性分析(表4)，群体间有效等位基因数最小为1.653 个，最大为4.023 个，平均2.599 个;平均每个群体可扩增出16.121 个个体，检测到3.721个等位基因位点；Shannon’s 信息指数为0.520~1.463，均值为0.946；观测杂合度和期望杂合度分别为0.328~0.683 和0.385~0.714，平均分别为0.448和0.512。其中，DA 群体的Shannon’s 信息指数最高，为1.463，等位基因数和有效等位基因数分别为6.000 和4.017，表明DA 群体的遗传多样性最为丰富。

表4 益智群体的遗传多样性Table 4 Genetic diversity in Alpinia oxyphylla populations

群体遗传分化分析从表5 可见，益智群体的遗传分化系数Fst为0.043~0.265，平均为0.131，0.050≤Fst≤0.150 的有27 组，占比49.1%，0.150≤Fst≤0.250 的有15 组，占比27.3%，表明该益智种质大部分群体间处于中等偏高遗传分化程度。Z4和Z5 群体的遗传分化系数最高，为0.265，最低的是Z2 和Z3，为0.043。

表5 益智群体间的FstTable 5 Fst among Alpinia oxyphylla populations

AMOVA方差分析从表6 可见，在显著性水平P<0.001 下，20.87%的遗传变异发生在群体间,79.13%的遗传变异发生在群体内，说明益智群体遗传变异主要发生在群体内，群体间的遗传分化较低。

表6 益智群体变异的AMOVA 分析Table 6 AMOVA variation analysis of Alpinia oxyphylla populations

2.2 群体遗传结构分析

利用Structure 软件基于贝叶斯数学模型对166份益智种质资源进行初步群体结构分析，结果表明，当K 值为4 时，模型的后验概率最大(图1) 由此可见，将供试益智样本划分为4 个类型最为合适(图2)。从群体遗传结构图可以看出，群体Z2、Z3、Z4 和Z8 的遗传背景较为相似，群体Z5、Z9、Z10较为独立而各成一体，而群体Z1、Z6、Z7 存在一定的遗传渐渗(图2)。

图1 不同K 值时ΔK 值的变化Fig. 1 Changes in ΔK at different K values

图2 益智群体的遗传结构图。1~8: Z1~Z8; 9: DA; 10: YC。Fig. 2 Genetic structure map of Alpinia oxyphylla population. 1-8: Z1-Z8;9: DA; 10: YC.

PCoA 主坐标分析结果表明(图3)，所有个体在二维空间上表现出集群分布特征，大致可分为4 个区, A 区主要包含来自Z1、Z2、Z3、Z4、Z7 和Z8群体的个体，B 区主要包含来自Z1、Z5 和Z6 群体的个体，C 和D 区则分别来自YC 和DA 群体。其中，C 区的植株形态为叶小、中果，种子较小; D 区的植株形态为叶大、中果，种子较大；A 区的植株形态叶较小、果实有大有小，种子有大有小；B 区的植株形态为叶大、果实为小果，种子有大有小, 各类群与表型特征之间未呈现出明显关联性。

图3 主坐标分析图Fig. 3 Principal coordinate analysis map

3 结论和讨论

物种遗传分化程度的高低受地理范围、生态环境以及繁育系统等因素的影响[26-27]。Wright[28]首次将群体遗传分化程度进行了划分: 0≤Fst≤0.05 表示遗传分化极小，可以不考虑遗传分化; 0.05≤Fst≤0.15 表示处于中等水平；0.15≤Fst≤0.25 表示遗传分化较大；Fst≥0.25 表示遗传分化极大。本研究采用SSR 分子标记对166 份广东产益智种质进行遗传多样性分析，广东益智的遗传分化系数为0.043~0.265, Shannon’s 指数均值为0.946，高于海南产野生种质的0.337 3[12]，表明广东栽培的益智种质遗传多样性较高，遗传背景更为复杂。

本研究在形态分类的基础上对群体遗传结构分析，可将166 份广东益智种质分为4 大类群，基于PCoA 分析在二维空间上同样表现出集群分布特征，但4 个区域的益智植株个体并没有反映出形态特征的规律性，表现在基于分子标记的聚类结果出现较多的个体混杂现象，与基于形态的分类群体不能较好地实现一致性，可能的原因: 首先，益智主产海南，广东后于海南开展益智栽培，很长时间里，农户都自行从海南的不同地方分批引种，造成种源混杂，种质混乱的局面；其次，本研究所采用表型性状仅包含果实，叶片性状以及种子，而影响植物分类精确性的性状多达几十个[29]，因此性状数量不足将会造成分类误差，此外，植物表型性状容易受到人为选择和环境干扰的特性也会使分类结果产生误差[30]；第三，引物数量影响分子标记准确性, 本研究所选用引物为14 对，引物不足会使覆盖的基因组范围受到限制，导致基因组信息显示不全，从而对聚类结果产生影响。因此，后续研究应充分考虑多方面因素，提高植物形态分类和分子标记聚类的精确性。