时序性老化中皮肤形态学的变化及MMP1、MMP12定量分析研究

王文成，张亚文，马 瑞，张 伟，曹 池，李姝霖，田建英

（1.宁夏医科大学基础医学院，银川 750004；2.宁夏回族自治区人民医院，银川 750002）

皮肤老化程度是评估人的年龄的关键决定因素。皮肤老化是皮肤组织退化，表现为皮肤功能和结构衰退，适应性和防御能力下降，包括未出现明显临床病变的老年综合征和衰弱[1]。此外，人的皮肤随着年龄增加，失去弹性变得松弛而下垂[2-4]。皮肤老化与真皮中胶原纤维变性的时序性老化和光老化的累积有关[5]；这可能是年龄因素有关的皮肤老化。随着医疗技术飞速发展，预防皮肤老化是当今研究者的热门话题[6]。近些年，皮肤老化治疗效果取得了一定成效，但其治疗效果维持时间较短。本研究探讨不同年龄大鼠皮肤自然老化中的形态学变化规律及其机制。基质金属蛋白酶由成纤维细胞、巨噬细胞分泌，主要降解胶原纤维和弹力纤维，其在皮肤老化过程中扮演着重要角色。通过皮肤含水量评估皮肤老化程度，揭示皮肤老化的可能机制，为预防皮肤老化、研发抗衰新药物提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠48只，分青年组（4月龄，体质量180～200 g）、中年组（10月龄，体质量360～380 g）、老年组（24月龄，体质量540～560 g），每组16只，年龄分组依据文献[7-8]；剃干净大鼠背部6 cm×10 cm区域毛发，观察皮肤外观，腹腔麻醉后，冰上每组取8只大鼠背部正中新鲜皮肤1 cm×2 cm，用于做皮肤含水量、生化指标、ELISA、RT-PCR、电镜等实验，其中电镜数据分析参考文献[9]。采用4%多聚甲醛灌注，取大鼠背部正中皮肤1 cm×2 cm固定于4%多聚甲醛中，用于观察皮肤组织形态学变化。SD大鼠/实验场所由宁夏医科大学实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK（宁）2020-0001。

1.2 实验仪器和试剂

1.2.1 仪器 石蜡包埋机（型号：Histocore Arcadia H；徕卡显微系统公司），全自动石蜡切片机（型号：RM2265；徕卡显微系统公司），组织摊片烤片机（型号：TKY-TKA；湖北泰康医疗设备公司），黏附载玻片及盖玻片（型号：REF.188105；江苏世泰实验器材公司），电热恒温培养箱（型号：南京牌；南京实验仪器厂），光学显微镜（型号：BX51；奥林巴斯公司），透射电镜（型号：H7650；徕卡显微系统公司），电镜切片机（型号：UC7；徕卡显微系统公司），全自动样品冷冻研磨仪（型号：JXFSTPRP-CL；上海净信公司），酶标仪（型号：Varioskan Lux；赛默飞世尔公司），高速冷冻离心机（型号：Scientific；赛默飞世尔公司），均由宁夏医科大学实验室提供。

1.2.2 试剂 石蜡（德国徕卡公司，货号：1903142），维多利亚弹力纤维染色液（北京索莱宝科技有限公司，货号：G1596），亮绿SF染色液1%（北京索莱宝科技有限公司，货号：G1270），羟脯氨酸（HYP）试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：A030-2-1），MMP1、MMP12试剂盒（上海酶联生物公司，批号：ml1002968、ml1059520），BCA蛋白含量检测试剂盒（江苏凯基生物公司，批号：KGP902）。

1.3 实验方法

1.3.1 组织染色及图像分析[10-17]将组织石蜡块垂直切片（vertical section），厚度3μm，用黏附载玻片分别捞取，放入65℃烘烤载玻片1 h，后放入4℃冰箱储存。按照HE染色、Masson（亮绿）、维多利亚蓝染色的实验操作步骤进行脱蜡、染色、中性树脂封片，用奥林巴斯系统分别采集HE×40、HE×200、Masson染色和维多利亚蓝染色×400倍镜下图片。图片使用Image Pro Plus 6.0软件按体视学原理分析垂直截面图像，面积分数=体积分数，反映胶原纤维和弹力纤维在大鼠真皮层所占体积百分数。每组10张组织切片，每张切片随机测定10个值后取平均值。透射电镜每个样本采集10张，电镜下观察胶原原纤维变化、测量胶原原纤维直径、横纹周期、间距、密度等指标。

1.3.2 皮肤含水量测定[18-19]取背部皮肤组织1 cm×1 cm，除去皮下脂肪组织，放入包埋盒中，用电子天平精确称量皮肤湿重；80℃烘箱烘干24 h，精密称量皮肤干重。根据以下公式计算皮肤水分含量：皮肤水分（%）=（皮肤湿重-皮肤干重）/皮肤湿重×100%。

1.3.3 碱水解法检测皮肤HYP含量[20]电子天平精准称取每组皮肤组织湿重然后放入EP管中，加入水解液混匀，95℃水浴水解20 min，调pH值至6.0～6.8，离心10 min取上清做检测。HYP含量（μg/mgprot）=（测定OD值-空白OD值）/（标准OD值-空白OD值）×标准品浓度（5μg·mL-1）×水解液总体积（mL）/组织湿重（mg）。HYP是胶原组织重要的代谢指标，测定胶原蛋白的含量一般用HYP的7.46倍换算，皮肤胶原蛋白含量=HYP含量×7.46。

1.3.4 ELISA法检测MMP1、MMP12含量[21-23]将大鼠皮肤组织称重后，用剪刀剪碎组织放入研钵，倒入液氮将组织研磨至粉末状，加入PBS液，磁珠分离法匀浆，离心后取上清，用BCA法分别测每组大鼠皮肤组织的蛋白浓度。按照上海酶联试剂盒操作计算得出每组MMP1、MMP12的浓度，再除以每组皮肤组织蛋白浓度。

1.3.5 Real-time PCR测定SD大鼠皮肤组织中的MMP1、MMP12的表达[24-25]SD大鼠皮肤总RNA提取和cDNA合成，根据Trizol法提取SD大鼠皮肤RNA，分别测定获取每组RNA浓度和其A260/A280值。取2μL总RNA逆转录合成cDNA，反应体系为20μL，反应条件为5℃1 h，99℃15 min，5℃5 min，获取cDNA置于-80℃保存备用。聚合酶链反应（PCR）扩增MMP1、MMP12引物序列（表1），PCR扩增反应体系20μL，反应条件为50℃2 min，95℃3 min，95℃20 s，58℃20 s，72℃20 s，39个循环。将所得CT值按照2-△△CT的方法处理数据。

表1 RT-PCR检测引物序列

1.4 统计学方法

采用SPSS 25.0统计学软件进行数据分析。实验数据用均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析进行组间比较。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 皮肤形态学观察

2.1.1 表皮与真皮观察 光镜下，青年组大鼠表皮突呈波浪状，幅度小，角质层薄，真皮胶原染色呈浅红色，胶原束排布紧密，附属器丰富；与青年组大鼠比较，中年大鼠表皮无明显差异，表皮突波浪状明显，附属器数量减少。老年大鼠表皮突显著波浪状，发生皱缩，附属器数量减少；与中年组大鼠比较，老年组大鼠表皮突波浪幅度较大，发生皱缩，真皮萎缩变薄，附属器数量减少，见图1A、1B。

与青年组大鼠比较，中年组大鼠表皮厚度差异无统计学意义（P＞0.05），但真皮厚度变薄（P＜0.05），老年组大鼠表皮、真皮厚度均变薄（P均＜0.05）。与中年组大鼠比较，老年组大鼠表皮、真皮厚度均变薄（P均＜0.05），见图1C、1D。

图1 不同年龄鼠表皮、真皮厚度变化

2.1.2 胶原纤维与弹力纤维观察 光镜下，青年组大鼠真皮胶原纤维较致密、呈波浪状、整齐有序、分布均匀，胶原束走向与表皮平行，胶原束间间隙较小，弹力纤维呈细长的分支状，穿梭于胶原纤维间，真皮浅层、深层空间排列较规则；与青年组大鼠比较，中年组大鼠真皮胶原较疏松，胶原束空间排列欠规律，大部分与表皮走向平行，少数胶原纤维变性、均质化、排布散乱，弹力纤维空间排列疏散，可见少数断裂、缠结、粗化，大部分分布于真皮浅层，真皮深层弹力纤维散在分布显著减少；老年组大鼠真皮胶原疏松显著，胶原束空间排列紊乱，极少数胶原束走向与表皮平行，胶原束间间隙显著增大，大多胶原束断裂，胶原纤维变性、均质化显著，大部分弹力纤维断裂、缠结、粗化，特别是真皮深层几乎未见弹力纤维穿梭于胶原纤维间，空间排布紊乱。与中年组大鼠比较，真皮胶原疏松，胶原束空间排列较紊乱，胶原束走向与表皮平行，胶原束间间隙增大，胶原束断裂，胶原纤维变性、均质化显著，弹力纤维断裂、缠结、粗化，特别是真皮深层几乎未见弹力纤维穿梭于胶原纤维间，空间排列紊乱，见图2A、2B。

与青年组大鼠比较，中年组大鼠胶原纤维含量差异无统计学意义（P＞0.05），但弹力纤维含量减少（P＜0.01）；老年组大鼠胶原纤维含量、弹力纤维含量均减少（P均＜0.01）。与中年组大鼠比较，老年组大鼠胶原纤维含量、弹力纤维含量均减少（P均＜0.01），见图2C、2D。

图2 不同年龄鼠真皮胶原纤维、弹力纤维变化

2.1.3 超微结构观察 大鼠真皮透射电镜下观察，数百根胶原原纤维组成胶原束。青年组大鼠横断面胶原束排列紧密，胶原束间距小，排列整齐，束内胶原原纤维排列均匀有序，粗细均一，平均直径94.8 nm，胶原原纤维间距平均为17.2 nm，平方纳米单位面积下胶原原纤维的数量平均66根左右，每根胶原原纤维的横纹周期116.4 nm。与青年组大鼠比较，中年组大鼠真皮横断面胶原束疏散、胶原束间距大、排列较齐，束内胶原原纤维间距显著增大，排列均匀整齐；与青年组大鼠比较，老年组大鼠真皮横断面胶原束疏松、胶原束间距明显增大、排列散乱，束内胶原原纤维排列无序。与中年组大鼠比较，老年组大鼠横断面胶原束疏松、胶原束间距明显增大、排列散乱，束内胶原原纤维排列无序、粗细不匀，见图3A、3B。

与青年组大鼠比较，中年组大鼠真皮横断面胶原原纤维直径增大、横纹周期缩短、间距增大、密度减少（P均＜0.05）；老年组大鼠真皮横断面胶原原纤维直径减小、横纹周期缩短、间距减小、密度增加（P均＜0.05）。与中年组大鼠比较，老年组大鼠横断面胶原原纤维直径减小、横纹周期缩短、间距减小、密度增加（P均＜0.05），见图3C、3D、3E、3F。

图3 不同年龄鼠真皮层胶原原纤维透射电镜观察

2.2 皮肤含水量、胶原蛋白、HYP变化

随着年龄的增长，与青年组大鼠相比，中年组、老年组大鼠皮肤含水量、胶原蛋白含量、HYP含量均下降（P均＜0.05），与中年组大鼠比较，老年组大鼠皮肤含水量、胶原蛋白含量、HYP含量均减少（P均＜0.05），见图4。

图4 不同年龄鼠皮肤含水量、胶原蛋白和HYP的含量变化

2.3 皮肤MMP1、MMP12变化

与青年组相比，中年组、老年组的MMP1和MMP12活力均增强（P均＜0.05），与中年组比较，老年组的MMP1和MMP12活力均增强（P均＜0.05），见图5。

图5 不同年龄鼠皮肤MMP1、MMP12的影响

2.4皮肤MMP1mRNA、MMP12mRNA的表达水平

与青年组相比，中年组、老年组的MMP1mRNA和MMP12mRNA表达水平均增高（P均＜0.05），与中年组比较，老年组MMP1mRNA和MMP12mRNA表达水平均增高（P均＜0.05），见图6。

图6 不同年龄鼠皮肤MMP1、MMP12的mRNA表达水平

3 讨论

皮肤老化与实际年龄、表观年龄有密切关系[26]。胶原纤维是人体含量最多的一种纤维，由胶原蛋白、氨基酸、甘氨酸、脯氨酸和HYP、微量元素等组成[27-28]。胶原纤维广泛分布于机体各器官内，皮肤、巩膜和肌腱最为丰富，也是皮肤的基本结构物质。而成纤维细胞分泌MMP1降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原，巨噬细胞分泌MMP12降解弹力纤维[24，29]。本研究发现，MMP1、MMP12水平增高，与大鼠真皮中胶原纤维和弹力纤维含量呈年龄依赖性下降。同时，胶原蛋白代谢产物HYP也随年龄增加含量下降，表明皮肤胶原肽键和弹力网断裂，其螺旋网状结构遭到破坏。基质金属蛋白酶在皮肤老化中激活，对于皮肤时序性老化具有重要作用。

本文从超微结构证实胶原原纤维的退化。胶原原纤维是构成胶原纤维的超微结构单位，形成胶原原纤维的基本单位则是原纤维胶原蛋白，胶原蛋白（或称胶原）是由3条α多肽链形成的三股螺旋结构，这也是胶原蛋白的基本特征。原纤维胶原蛋白在成纤维细胞内粗面内质网上自我装配受到一定程度破坏。皮肤胶原纤维的抗张强度与胶原原纤维的数量、直径、排列、间距有密切的关系[30]。本研究观察了自然老化鼠胶原原纤维变化，结果证实随年龄增长胶原原纤维呈时序性退化。

综上所述，皮肤老化是评价机体老化程度的重要外在表现。同时，皮肤与机体其他组织不同，不仅受外源性老化的影响，还受内源性老化的影响，但内源性老化占主导作用。目前，大多研究皮肤老化模型多聚焦在单一外在因素的模型制备，而最新的皮肤老化理论考虑年龄和环境等多因素的作用，是反映皮肤老化的合理模型，年龄因素为内源性和外源性因素重叠。本文通过电镜深入观察其亚微结构胶原原纤维的年龄时序性变化，为真皮胶原纤维退化提供了新佐证，为皮肤美容、皮肤疾病治疗、研发新药物提供理论依据。