KAI1、Snail、Slug、E-cadherin 在鼻咽癌中的表达及其与患者预后的关系

施雨南，陈志平，肖秋香，周春燕，张珊毓，衷敬华

（1.赣南医学院第一临床医学院，江西 赣州 341000；2.赣南医学院第一附属医院检验科，江西 赣州 341000；3.赣南医学院第一附属医院病理科，江西 赣州 341000；4.赣南医学院第一附属医院肿瘤科，江西 赣州 341000）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma）在我国华南地区较常见。鼻咽癌可局部侵袭和转移至区域淋巴结及身体其他部位[1]。近年来，虽然调强放疗技术（IMRT）有了很大的改善，但鼻咽癌总体5 年生存率并没有明显改善[2]。转移和复发是治疗失败的主要原因[3]。鼻咽癌的进展和转移与一些分子变化密切相关，但这些分子目前很少能用于预测预后。KAI1又称CD82，是位于人类染色体11p11.2 上的四倍体蛋白家族的重要成员。KAI1 最初被认为是前列腺癌细胞转移的抑制因子，该基因编码10 个外显子和9个内含子。KAI1 基因在生物行为中错综复杂，包括移动、迁移、粘附、融合和侵袭[4]。研究表明，KAI1 的异常表达与许多人类癌症的发生发展密切相关。越来越多的证据表明，KAI1 可能是一种重要的生物标志物，用于预测胃癌、结直肠癌、前列腺癌[5]的侵袭、转移和预后。上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是指上皮细胞在特定的生理和病理条件下转化为间充质细胞，同时上皮标记物（如E-cadherin、CK)表达减少，间充质标记物（如vimentin、Twist、Slug、Snail）表达增加。EMT 被认为是肿瘤侵袭和转移的关键步骤。Snail 又称锌指转录因子，是EMT 过程中的关键转录因子。通过与启动子中的E-box 结构结合，抑制E-cadherin 的转录，导致细胞间粘附减少，诱导EMT 的发生，促进浸润转移[6，7]。转录因子Slug 也属于锌指结构家族，与Snail结构相似，是高度保守的羧基末端，带有一个可变的氨基末端，包含4～6 个锌指结构，也是EMT 过程的重要调控因子[8]。Slug 还通过与目的基因上的E-box结构结合抑制E-cadherin 的表达，促进EMT 的形成。E-cadherin 是维持细胞形态和结构完整的重要分子，普遍存在于各种上皮细胞中，主要介导细胞间的粘附反应，起细胞骨架的作用。E-cadherin 表达减少或丢失与肿瘤分化不良、高侵袭、高转移、肿瘤复发呈正相关。它是预测肿瘤进展和预后的重要指标，是肿瘤侵袭转移的抑制因子[9]。然而，在鼻咽癌中，KAI1 与Snail、Slug、E-cadherin 在EMT 过程中的作用尚未完全明确。本研究主要观察KAI1 和Snail、Slug、E-cadherin 表达、相关性及对预测鼻咽癌的预后作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2011 年6 月-2015 年7 月赣南医学院第一附属医院病理科存档石蜡包埋的212 例鼻咽癌组织标本（未行放疗或化疗），50 例鼻咽部黏膜炎组织标本，正常鼻咽上皮组织标本40 例，收集了患者临床病理特征和随访数据。本研究根据《赫尔辛基宣言》指南进行，并获得赣南医学院第一附属医院伦理委员会的授权[10]。患者TNM 分期根据美国癌症联合委员会（AJCC）[11]发布的指南第8 版进行评估。血浆中EB 病毒DNA（EBV-DNA）阳性定义为血浆中EB 病毒DNA 拷贝数超过500 拷贝/ml。随访至患者死亡或至2020 年7 月，随访时间为12～84个月。根据WHO 组织分型标准，212 例鼻咽癌中198 例为非角化性鳞状细胞癌，14 例为角化性鳞状细胞癌；诊断时中位年龄为46.5 岁（27～82 岁），≥60 岁135 例，＜60 岁77 例；男139 例，女73 例；EBDNA 阳性188 例，阴性24 例；肿瘤直径≥3.0 cm 126 例，＜3.0 cm 86 例；206 例出现颈部淋巴结转移（≥N1）；远处转移（M1）30 例；根据TNM 分期标准，Ⅰ+Ⅱ期16 例（7.54%），Ⅲ+Ⅳ期196 例。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学 将鼻咽癌组织、鼻咽部黏膜炎组织和正常鼻咽组织标本固定在10%的缓冲形成液中，石蜡包埋，切成4 μm 厚的薄片。免疫组化染色采用Elivision TM Plus 法，所有的切片用二甲苯脱蜡，用酒精脱水，然后用常规H2O2溶液猝灭内源性过氧化物酶活性，抗原用柠檬酸缓冲液修复，用山羊血清阻断所有组织。KAI1（小鼠单克隆抗体，Abcam，USA）、Slug 和Snail（小鼠单克隆抗体）；E-cadherin（兔多克隆抗体；Assay Biotech，USA），加入一抗，所有切片在4 ℃孵育过夜。加入增强剂（试剂A和试剂B），所有薄片在二氨基联苯胺（DAB）溶液中显影。所有的切片都用苏木精浸泡，脱水，固定。

1.2.2 免疫组化染色评价 考虑到肿瘤内的异质性，在每个鼻咽癌切片中随机指定10 个高倍视野（HPF），根据阳性细胞和阳性染色强度，将染色结果乘以百分比和强度评分。百分比评分：＞11%为1 分，11%～50%为2 分，51%～75%为3 分，＞75%为4 分。强度评分：未染色为0 分，弱染色为1 分，中等染色为2 分，强染色为3 分，评分范围为0～12 分。当最终评分为＞2 分时，Slug 和Snail 的表达为阳性。

1.3 统计学分析 应用SPSS 20.0 软件分析本实验数据，计量资料数据以采用（）表示，行t检验；计数资料以[n（%）]表示，行X2检验；采用Fisher 精确检验或X2比较临床特征与KAI1、Snail、Slug、Ecadherin 的相关性；采用列联表资料的关联性分析比较KAI1 与Snail、Slug 与E-cadherin 之间的关系；采用单因素和多因素分析确定KAI1、Snail、Slug或E-cadherin 对生存率的影响；独立预后因素采用Cox 回归模型进行多因素分析；采用Kaplan-Meier法结合Log-rank 检验进行单因素总生存分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 KAI1、Snail、Slug、E-cadherin 在鼻咽癌组织中的表达及与临床特征的相关性 Snail 阳性表达主要位于细胞核，鼻咽癌组织中Snail 表达阳性率[65.09%（138/212）]高于鼻咽部黏膜炎组织[34.00%（17/50）]和正常鼻咽上皮组织[5.00%（2/40）]，差异有统计学意义（P＜0.05）；Slug 阳性表达主要位于细胞质中，鼻咽癌组织中Slug 阳性表达率[65.09%（138/212）]高于鼻咽部黏膜炎组织[36.00%（18/50）]和正常鼻咽上皮组织[5.00%（2/40）]，差异有统计学意义（P＜0.05）；KAI1 的阳性表达主要位于细胞质和细胞膜，KAI1在鼻咽癌组织中的表达阳性率[25.94%（55/212）]低于鼻咽部黏膜炎组织[68.00%（34/50）]和正常鼻咽上皮组织[90.00%（36/40）]，差异有统计学意义（P＜0.05）。E-cadherin 在鼻咽癌组织中的表达阳性率[31.60%（67/212）] 低于鼻咽部黏膜炎组织[72.00%（36/50）]和正常鼻咽上皮组织[90.00%（36/40）]，差异有统计学意义（P＜0.05）；鼻咽癌中Snail、Slug 表达阳性率与EB-DNA 水平、肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移、TNM 分期呈正相关；鼻咽癌中KAI1、Ecadherin 的表达阳性率与EB-DNA 水平、肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移和TNM 分期呈负相关。鼻咽癌组织中KAI1、Snail、Slug、E-cadherin 的表达与年龄、性别、组织分型无相关性（P＞0.05）；见图1、表1。

图1 KAI1、Snail、Slug、E-cadherin 在鼻咽癌组织中的表达（DAB 染色×400）

表1 KAI1、Snail、Slug、E-cadherin 与鼻咽癌临床病理特征的相关性（n）

表1 （续）

2.2 鼻咽癌中KAI1、Snail、Slug、E-cadherin 的相关性KAI1 表达与Snail、Slug 呈负相关，与E-cadherin 呈正相关；E-cadherin 表达与Snail 和Slug 呈负相关；Snail 与Slug 表达呈正相关，见表2。

表2 鼻咽癌中KAI1、Snail、Slug、E-cadherin 的相关性（n）

2.3 单因素和多因素分析影响鼻咽癌患者预后的危险因素 单因素分析显示，Snail（+）和Slug（+）患者的总生存时间短于Snail（-）和Slug（-）患者，KAI1（+）和E-cadherin（+）患者的总生存期长于KAI1（-）和E-cadherin（-）患者（P＜0.05）；多因素分析显示，KAI1、Snail、Slug、E-cadherin、淋巴结转移、远处转移、TNM 分期是影响鼻咽癌患者预后的独立危险因素，见表3、表4。

表3 单因素分析影响鼻咽癌患者预后的危险因素（，个月）

表3 单因素分析影响鼻咽癌患者预后的危险因素（，个月）

表4 多因素分析影响鼻咽癌患者预后的危险因素

2.4 生存分析 Kaplan-Meier 生存分析显示，KAI1 蛋白表达阳性患者的平均生存时间高于阴性患者（Log-rank=10.559）；Snail 表达阳性患者的平均生存时间短于Snail 表达阴性患者（Log-rank=13.343）；Slug 表达阳性患者的平均生存时间短于Slug 阴性患者（Log-rank=14.722）；E-cadherin 表达阳性患者的平均生存时间高于E-cadherin 阴性患者（Logrank=14.523），见图2。

图2 鼻咽癌患者的Kaplan-Meier 生存分析

3 讨论

转移是鼻咽癌患者预后不良的主要原因，发现特异性与稳定性较好的生物标志物来预测疾病的侵袭和转移具有重要意义。本研究主要评估KAI1、Snail、Slug 和E-cadherin 在鼻咽癌中的表达及相关性，以期为确定鼻咽癌的预后和转移提供新的方法。

既往研究表明[12-15]，KAI1 在胃癌、结直肠癌、前列腺癌等多种肿瘤中均能抑制肿瘤转移。这些发现表明KAI1 可能是一个重要的生物标志物，可用于多种人类癌症的转移和预后。本研究发现，KAI1 的阳性表达在正常鼻咽上皮组织、鼻咽部黏膜炎组织、鼻咽癌组织中逐渐降低。此外，KAI1 的阳性表达与EB-DNA 水平、肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移、TNM 分期及鼻咽癌预后有关，提示KAI1 蛋白缺失可能参与鼻咽癌的发生、发展、侵袭和转移。Kaplan-Meier 生存分析显示，KAI1 蛋白表达阳性患者的生存时间高于阴性患者。

上皮间质转化是指上皮细胞极性丧失，黏附减少或丧失，形态由圆形或长方体变为梭形，运动能力增强，容易脱离母细胞，引起浸润和转移。此外，上皮相关标志物表达减少或丢失，而间质相关标志物表达增强。近年来研究发现，大多数上皮性恶性肿瘤在侵袭转移过程中可能伴有EMT。此外，最近的研究表明，Snail 蛋白的异常表达参与了肿瘤细胞的侵袭和转移，其表达的增加可能提示预后不良。Snail 可由TGF-、EGF、Wnt、Notch 等多种刺激因子诱导。TGF-可调控PI3K/Akt 信号通路，PI3K/Akt 信号通路的激活是EMT 过程的核心信号。因此，PI3K/Akt 信号通路与TGF-可协同EMT 诱导过程。这些结果表明，Snail 与EMT 过程存在一定的关系[16-19]。本研究发现，鼻咽癌中Snail 蛋白阳性表达率高于鼻咽部黏膜炎组织和正常鼻咽上皮组织。此外，Snail蛋白阳性表达与EB-DNA 水平、肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移、TNM 分期及鼻咽癌预后有关，提示Snail 蛋白阳性表达的鼻咽癌细胞分化较差，易浸润转移，Snail 蛋白的阳性表达可能参与了鼻咽癌的发生、发展、侵袭和转移。Kaplan-Meier 生存曲线显示，Snail 表达阳性患者生存时间短于Snail 表达阴性患者，提示Snail 表达阳性患者预后较差。

Slug 和Snail 都属于Snail 家族，都含有锌指结构，锌指结构是EMT 的关键调控因子，能够抑制E-cadherin 的表达。Slug 在上皮恶性肿瘤中的表达增加通常表明EMT 和侵袭易感性。近期研究发现，Slug 蛋白在多种上皮性恶性肿瘤中均可异常表达，如头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌等[20，21]。本研究发现，Slug 蛋白的阳性表达在鼻咽癌组高于鼻咽部黏膜炎组织和正常鼻咽上皮组织。Slug 蛋白的阳性表达率与EB-DNA 水平、肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移、TNM 分期及鼻咽癌的预后均相关。此外，Slug 蛋白阳性表达的患者生存时间短于阴性表达的患者。这些结果提示Slug 蛋白表达异常升高可能参与了鼻咽癌的发生、发展、浸润和转移。

E-cadherin 是EMT 过程中重要的上皮标志物。当E-cadherin 表达减少时，各上皮细胞的粘附减少，细胞形态由圆形或扁平变为纺锤形，运动能力增强，分化为间质细胞[22-24]。本研究发现，E-cadherin的阳性表达率在正常鼻咽上皮组织、鼻咽部黏膜炎组织、鼻咽癌组织中逐渐降低，E-cadherin 的阳性表达与上述相同的临床特征均相关，提示E-cadherin 与KAI1 具有相同的作用。越来越多的研究表明，降低KAI1 的表达可抑制E-cadherin 的表达，从而降低E-cadherin/-catenin 复合物的稳定性，导致上皮性肿瘤的运动性增加，促进EMT 的发生，促进肿瘤的侵袭转移。

在本研究中，Snail 和Slug 在正常鼻咽上皮组织中的表达较低，而在鼻咽部黏膜炎组织和鼻咽癌组织中表达逐渐升高。KAI1 和E-cadherin 在正常鼻咽组织中表达较高，在鼻咽部黏膜炎组织和鼻咽癌组织中表达逐渐降低。相关性分析发现，随着鼻咽癌组织中KAI1 和E-cadherin 表达的降低，Snail和Slug 蛋白的表达增加，说明KAI1 和E-cadherin蛋白表达的减少或丢失与Snail 和Slug 表达的增加可能存在一定的相关性。本研究还发现KAI1 和E-cadherin 与Snail 和Slug 之间存在负相关，且多因素分析显示KAI1、Snail、Slug、E-cadherin 表达、淋巴结转移、远处转移、TNM 分期是影响鼻咽癌患者预后的独立危险因素。

综上所述，Snail、Slug 和E-cadherin 是EMT 中关键的转录因子和生物标志物，可能参与了鼻咽癌的发生、发展、侵袭和转移。当它们在鼻咽癌中表达异常时，KAI1 的表达降低或检测不到，这可能进一步促进鼻咽癌的侵袭转移。KAI1、Snail、Slug、Ecadherin 的表达与EB-DNA 水平、肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移、TNM 分期及鼻咽癌预后有关。因此，早期进行KAI1、Snail、Slug、E-cadherin 的联合检测可预测鼻咽癌的侵袭转移，也可作为预测鼻咽癌患者预后的有价值的指标。