云南苹果白纹羽病原菌的分离与鉴定

潘新龙，周 聪，寸海春，孔宝华，，何月秋，马锦泉，张彦明，赵升文，马 钧，曹克强，马永翠

(1 云南农业大学植物保护学院/农业生物多样性与病虫害控制教育部重点实验室，昆明，650201；2 昭通学院，云南昭通，657000；3 云南省泸西县果树站，云南泸西，652400；4 云南省曲靖市马龙区经作站，云南曲靖，655100；5 云南省鲁甸县苹果产业发展中心，云南鲁甸，657100；6 云南省农业科学院园艺作物研究所，昆明，650205；7 河北农业大学植物保护学院/国家苹果产业技术体系病虫害防控研究室，河北保定，071001)

苹果是世界四大水果之一，中国是世界第一大苹果生产国，种植面积和产量均占世界的40%以上[1]。云南属于西南冷凉高地苹果产区，也是我国南方重要的苹果生产基地。由于高原冷凉气候与充足的日照，云南苹果具有含糖量高、色红等独特的高品质特点。云南在滇东北的昭通、滇西北的丽江、滇东的马龙以及滇中的昆明市西山区等地建立了大批优质高产的苹果生产基地，使云南成为了全国优质苹果最佳产地之一[2]。

近年来，随着苹果种植面积的增大和种植环境的改变，各类苹果病害不断发生，且发病率呈上升趋势[3-5]。苹果园农药化肥的大量使用，使得土壤结构及微生物系统被破坏，根部病害也愈发严重。白纹羽病遍布全世界，在日本、西班牙等地是为害果树的主要根部病害[6-7]，在我国广泛分布于东北、华北、华中、华南等地[8-9]。病原寄主植物广泛，包括常见树木、蔬菜和禾本科作物，是为害果树根部的重要病害之一。果树发病后引起根腐，1～3年后整株死亡。该病潜伏在地下，果树发病初期与正常树差别不大，等到地上部分出现症状，即失去了早期防治的机会而无药可救。如果防控不当还会向全园蔓延，造成减产甚至毁园。但是，至今尚未见到对云南苹果白纹羽病较为系统的研究。本文就苹果白纹羽病的致病菌进行了初步研究，为防控该病奠定基础。

1 材料与方法

1.1 白纹羽病的分布调查

2019年5—9月，在云南昭通鲁甸县、昆明市西山区、曲靖市马龙区与红河州泸西县等苹果主产区调查地上部分生长衰弱至枯死的苹果植株，调查地下部分根系坏死情况，观察霉层出现情况。

1.2 试验材料

病害样本：采集苹果病根样品，装入干净的保鲜袋中带回实验室，于4 ℃冷藏箱中保存备用。

培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)。

试剂：北京擎科新业生物技术有限公司生产的PCR试剂盒与真菌通用引物ITS1/ITS4。

1.3 试验方法

1.3.1 病原菌的分离 采用方中达[10]的组织分离法分离病原菌。选取具有典型病害症状的苹果病根组织，用自来水轻轻冲洗干净，在病健交界处切取面积约3 mm×3 mm的病害组织块，依次用2.5%次氯酸钠与75%乙醇进行表面消毒[11]，无菌水冲洗干净后，于PDA培养基上25 ℃培养，直至长出菌落。取菌落边缘的菌丝纯化培养，3代后保存于PDA斜面试管中，置4 ℃冰箱内保存备用。

1.3.2 离体接种致病性测定 采用离体枝条接种法[12]。用健康的5 cm苹果小段枝条接种8 mm的菌丝块，每个枝条接种1块，3次重复，以接种无菌培养基块作为对照。用保鲜膜封住培养皿保湿，置于25 ℃恒温培养箱中培养，分别于接种后3、5、7、10和15 d观察记录枝条发病情况。

1.3.3 病原菌再分离 从接种的发病离体枝条的病健交界处分别剪取约3 mm×3 mm的病组织，按照上述组织分离法对病原菌进行再分离与鉴定，完成柯赫氏法则验证。

1.3.4 病原菌形态学观察 将纯化后的病原菌接种至PDA培养基，25 ℃培养7～20 d，观察菌落及菌丝的颜色和形态，以及孢子与菌核的形态等。参照文献[13]的方法对分离物进行形态学鉴定。

1.3.5 DNA提取、真菌ITS基因序列测序与序列分析 采用CTAB法[14]提取真菌基因组DNA，并使用由北京擎科新业生物技术有限公司合成的真菌通用引物ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)、ITS4(TCCTCGCTTAITGATATGC)进行PCR扩增。扩增程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性1 min；51 ℃退火1 min；72 ℃延伸1 min；35次循环；72 ℃延伸10 min。扩增结束后，1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR条带质量[11]。PCR产物送至擎科生物技术有限公司测序，测序结果利用DNA Star 5.01软件进行拼接和初步处理，在NCBI进行BLAST序列同源性比对。采用MEGA 5.0软件中的邻接法(Neighbor Joining，NJ)构建不同株系的系统进化树，靴带值(Bootstrap value)设置为500。

2 结果与分析

2.1 白纹羽病在云南的分布

经过调查，苹果白纹羽病典型症状在云南省昭通市鲁甸县、昆明市西山区、红河州泸西县以及曲靖市马龙区的苹果园出现。

2.2 白纹羽病树的症状特征

白纹羽病为害果树根部，引起根腐，病根表面缠绕白色或灰白色丝网状菌索(见图1)。菌丝穿过皮层侵入形成层深入木质部，导致全根腐烂，病树叶片发黄最终树体枯死。

图1 苹果白纹羽病为害症状

2.3 白纹羽病菌株的分离与致病性检测

从4个地区的病根样品中分离得到7个分离物，通过挑取菌落边缘的菌丝进行纯化培养。获得的菌落采用离体苹果枝条侵染的方法进行检测，在接种后5～15 d内均可明显见到枝条缠绕白色丝网状菌索(图2a下)，这种症状与果园里白纹羽病类似，而对照组(图2a上)未发现类似症状，15 d后形成褐色的水渍状圆形病斑(图2b左)，而对照组未发生变化(图2b右)，说明该分离物具有致病性，从致病性方面证明本研究分离获得的即为苹果白纹羽病病原菌。

a下为接种5 d，上为对照；b左为接种15 d，右为对照。

2.4 白纹羽病菌株的形态特征

将分离自苹果病根的病原菌接种于PDA平板培养基上，于培养箱中25 ℃恒温培养3 d，白色稀疏菌落直径可达(2.8±0.5)cm，继续培养5～7 d可覆盖整个培养皿(直径8.5 cm)。菌落呈圆形，边缘羽毛状，菌丝白色稀疏，边缘较中间部分浓密，基部无色素沉着，菌落背面白色，气生菌丝棉絮状(见图3a)，长满培养皿的菌落继续培养，表面常形成灰白色根状菌索或黑色近球形菌核(见图3b)。菌丝具有隔膜和分枝，分枝较细(见图3c)。分生孢子梗下部集成束状，淡褐色，上部分枝，无色；分生孢子顶生，卵圆形，单胞，无色，有黏质，大小为2～3 μm(见图3d)。形态学特征与褐座坚壳菌Rosellinianecatrix(Hart.)Berl特征一致。

a：棉絮状气生菌丝；b：根状菌索与黑色近球形菌核；c：具有隔膜和分枝的菌丝；d：无色单胞分生孢子。

2.5 白纹羽病菌株ITS序列测定与系统发育树分析

采用PCR技术，扩增分离的菌株STX1.E.3(GenBank登录号：MW659102)、TJX-6(Genbank登录号：MZ573412)、Y8-8(GenBank登录号：MW659099)与ZTZS-6(GenBank登录号：MZ577110)的ITS序列全长，在NCBI中应用BLAST进行序列比对。发现STX1.E.3(泸西)、TJX-6(昭通)与MK430555(西班牙鳄梨上的褐座坚壳菌)分离物同源性分别为99.80%与99.61%，ZTZS-6(昆明)、Y8-8(马龙)与HG964402(印度喜马偕尔邦苹果上的R.necatrix)分离物同源性一致为99.38%。可以确定该分离菌株为苹果白纹羽病菌褐座坚壳菌。

对具有致病性的云南苹果白纹羽病菌分离株序列，使用邻接法进行系统发育树分析。可以看出，分离菌株STX1.E.3(泸西)、TJX-6(昭通)与来自西班牙鳄梨上分离的MK430555组成一组；分离株ZTZS-6(昆明)、Y8-8(马龙)与来自印度喜马偕尔邦的苹果树上分离的褐座坚壳菌株HG964402组成一个组并且与其他分支的褐座坚壳菌的序列关系皆远。该研究表明，从红河州泸西县、昭通市鲁甸县分离到的菌株与西班牙鳄梨上的褐座坚壳菌最为接近，从曲靖市马龙区、昆明市西山区分离到的菌株与印度苹果上的褐座坚壳菌最为接近(见图4)。

图4 褐座坚壳菌ITS序列系统进化树

3 结论与讨论

苹果白纹羽病为苹果根腐病的一种，由于发生零星，研究较少，目前尚无该病在云南苹果产区的鉴定研究报道。云南苹果产区是否存在该病尚不明确。白纹羽病在日本、印度与西班牙等国家均有发生为害，在我国分布普遍，但是，有关为害苹果的白纹羽病的研究报道不多。本研究应用组织分离、病原形态鉴定、ITS分子鉴定以及致病性测定，鉴定明确了苹果白纹羽病。这是苹果白纹羽病首次在云南苹果产区的鉴定报道。

分析来自云南不同苹果产区的白纹羽病菌分离株rDNA-ITS序列，发现本试验分离株STX1.E.3(泸西)、TJX-6(昭通)与来自西班牙鳄梨上分离的MK430555组成一组；分离株ZTZS-6(昆明)、Y8-8(马龙)与来自印度喜马偕尔邦的苹果树上分离的褐座坚壳菌株HG964402组成一个组并且与其他分支的褐座坚壳菌的序列关系皆远。该研究表明，从云南省红河州泸西县、昭通市鲁甸县分离到的菌株与西班牙鳄梨上的褐座坚壳菌最为接近，从曲靖市马龙区、昆明市西山区分离到的菌株与印度苹果上的褐座坚壳菌最为接近。研究表明，来自苹果白纹羽病的褐座坚壳菌与地域和寄主相关不大。

对云南苹果主产区进行普查，发现在滇南红河州泸西县、滇东北昭通市鲁甸县、滇东曲靖市马龙区与滇中昆明市西山区均有白纹羽病，对该病应该引起足够的重视。这可能与近年来过量施用化肥、农药从而导致土壤微生物菌群失调有密切的关系，值得今后深入研究。