三种百香果病毒在贵州的发生分布

任羽羽，王立娟，陈 楠，袁启凤，马玉华

(1 贵州大学农学院，贵阳，550025；2 贵州省农业科学院果树科学研究所，贵阳，550006)

百香果又称西番莲PassifloracoeruleaL.，原产自南美洲，是西番莲科(Passifloraceae)西番莲属的一种藤本植物[1]。我国台湾于1901年引入百香果，目前在台湾、福建、广东、广西、重庆、云南和贵州等地都有栽培[2]。百香果因其具有多种水果香味而得名，蕴含丰富的营养价值[3]，加上百香果当年种植当年结果，具有产值高和见效快等特点[4]。

病毒病害是引起百香果品质降低和减产的重要因素，可造成叶片花叶、畸形、黄化、斑驳，以及果实畸形、木质化等症状[5]。百香果以无性繁殖为主，随着百香果品种增多和大面积推广种植，加快了病毒病的蔓延。目前国内外已报道32种可侵染百香果的病毒，我国主要有10种。Cheng等[6]最早在台湾地区检测出大戟曲叶病毒(Euphorbialeafcurlvirus，ELCV)和广东番木瓜曲叶病毒(PapayaleafcurlGuangdongvirus，PaLCuGdV)两种双生病毒属病毒；徐平东等[7]等、谢丽雪等[8-9]和Xie等[10]在福建地区百香果上检测到黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus，CMV)、夜来香花叶病毒(Telosmamosaicvirus，TeMV)、东亚西番莲病毒(EastAsianPassifloravirus，EAPV)和西番莲严重斑驳相关病毒(Passionfruitseveremottle-associatedvirus，PfSMAV)。谢慧婷等[11]、李战彪等[12]和黄诚梅等[13]在广西地区百香果上检测到CMV、TeMV、EAPV、EuLCV(一品红曲叶病毒，Euphorbialeafcurlvirus)、PaLCuGdV和PWV(西番莲木质化病毒，Passionfruitwoodinessvirus)；宋若楠等[14]和Chen等[15]在广东地区检测到西番莲斑驳病毒(Passionfruitmottlevirus，PaMV)和芜菁花叶病毒(Turnipmosaicvirus，TuMV)；张绍康等[16]在广西和云南省的百香果上检测到南瓜蚜传黄化病毒(Cucurbitaphid-borneyellowvirus，CABYV)。严佳文等[17]在贵州地区检测到 CMV和TeMV，从而首次为贵州百香果感染病毒病提供了依据。前期通过对疑似病毒侵染的百香果样品进行高通量测序和病毒种类鉴定，结果发现混样中存在TeMV、EAPV和西番莲潜隐病毒(Passifloralatentcarlavirus，PLV)这3种病毒，且病毒含量较高，其他病毒含量极低，检测结果中并未发现CMV。本研究通过调查TeMV、EAPV和PLV在贵州百香果上的发生、分布，以期为后期百香果病毒病的防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

2020年6月至2021年6月，在贵州省镇宁县、贞丰县、关岭县和罗甸县百香果主要种植地采集主要表现叶片斑驳、皱缩及黄化等疑似感病症状的百香果叶片105份，所有叶片均用液氮处理后置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.2 方法

1.2.1 总RNA的提取 采用RNA提取试剂盒(普洛麦格北京生物技术有限公司产)，参照说明书提取百香果叶片总RNA。利用超微量分光光度计(IMPLEN)测定提取核酸的浓度和纯度，使用琼脂糖凝胶电泳检测提取的总RNA质量。检测合格的总RNA使用反转录试剂(Thermo Scientific)合成cDNA，具体步骤参照说明书，最后保存于-20 ℃备用。

1.2.2 引物合成 根据GenBank中夜来香花叶病毒TeMV(DQ851493)、东亚西番莲病毒EAPV(AB246773)和西番莲潜隐病毒PLV(MT723990)基因组序列，利用Primer Premier 5.0软件，针对TeMV、EAPV和PLV的CP基因设计特异性引物，引物设计后经Blast比对保证其特异性，由上海生工生物工程股份有限公司进行合成(见表1)。

表1 3种病毒RT-PCR检测特异性引物

1.2.3 cDNA合成及PCR扩增 以提取总RNA为模板，反转录合成第一链cDNA。检测反应体系包括：Dream Taq Green PCR Master Mix(2×)为10 μL，上下游引物(10 μmol/L)为0.5 μL，cDNA为2 μL，用ddH2O补足后混合均匀，总体积为 20 μL。具体反应条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，循环35次；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取扩增产物5 μL进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统观察电泳结果。

1.2.4 PCR产物测序分析 采用DNA凝胶回收试剂盒(大连TaKaRa宝生物有限公司产)将目的片段进行回收纯化，将纯化回收后的PCR产物送测序，将测序结果与NCBI数据库里序列进行Blast比对分析。

1.2.5 病毒RT-PCR体系灵敏性检测 以复合感染3种病毒的百香果总RNA的反转录产物为试验样本，按照10倍梯度稀释法依次将模板稀释为10、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，在上述体系及条件下分别对3种病毒引物灵敏性进行分析。

1.2.6 RT-PCR检测方法的应用 从贵州省镇宁县、贞丰县、关岭县和罗甸县百香果种植地中随机共采集疑似感病的百香果样品105份，应用RT-PCR方法对样品进行检测，统计分析检测结果。

2 结果与分析

2.1 总RNA提取质量

试验提取样品总RNA的OD 260/OD 280比值均在1.9～2.2范围内，表明总RNA质量合格，可满足后续试验要求。

2.2 3种病毒RT-PCR扩增

结果显示，各引物对均能扩增出特异性条带，条带位置与预期产物大小(463、559和261 bp)基本吻合，条带清晰无杂带(见图1)。

注：M.DNA marker，1.TeMV，2.EAPV，3.PLV，4.对照(空白)。

2.3 RT-PCR的特异性分析

测序结果显示，3种病毒核苷酸序列与已报道的TeMV、EAPV和PLV序列有较高的相似性，其中，TeMV、EAPV和PLV与已报道分离物核苷酸序列相似性分别为98.6%(KJ789129)，99.4%(MG650164)和94.9%(MT723990)。结果表明，试验所用的引物适用于TeMV、EAPV和PLV的检测。

2.4 RT-PCR的灵敏性分析

TeMV、EAPV和PLV 3种病毒的cDNA的稀释极限分别为10-5、10-4和10-6。因此，在cDNA的10-4稀释液中能同时检测到TeMV、EAPV和PLV 3种病毒，利用超微量分光光度计测得cDNA的10-4稀释液最低浓度约89.65 ng/μL(见图2)。

注：A.TeMV，B.EAPV，C.PLV，M.DNA marker；1～7.依次为10、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7cDNA稀释液。

2.5 RT-PCR技术检测百香果感病情况

选择健康植株的RNA提取物作为阴性对照，检测结果正常，未扩增出条带。应用RT-PCR方法对贵州省主要百香果种植地百香果进行检测，统计检测结果发现，百香果感染了多种病毒，其中TeMV病毒侵染率最高，高达100%；其次EAPV病毒，侵染率高达81.9%；而PLV病毒侵染率为74.3%。

105份百香果样品中，所有地区的样品均检测到TeMV；镇宁县、贞丰县和罗甸县等地的EAPV与PLV的检出率较高，达到80%以上；关岭县15份样品均未检出EAPV，且仅有20%的样品检测到PLV(见表2)。说明贵州省采样的4个主产区百香果均受到不同程度的病毒侵染，部分地区病毒侵染情况严重。

表2 贵州省百香果样品中病毒检测结果

3 结论与讨论

本研究前期通过高通量测序方法对采集的疑似病毒侵染的百香果样品进行病毒种类鉴定，结果发现3种主要病毒分别为TeMV、EAPV和PLV。目前对TeMV和EAPV两种病毒的报道较多，谢丽雪等[9-10]首次报道侵染百香果的TeMV和EAPV的阳性检出率仅为1.8%和1.7%；谢慧婷等[12]对广西地区百香果进行检测时发现，TeMV和EAPV的阳性检出率分别为64.2%和41.3%。本研究中，TeMV和EAPV检出率分别为100%和81.9%，远高于之前的研究结果。可能是种苗主要来源于广西和福建地区，也可能是本研究采集的样品相对较多，加上贵州地区百香果种植面积较大，导致病毒传播速度快。目前这2种病毒在种植区普遍存在，是感染百香果的优势病毒。

目前国内鲜有PLV侵染百香果的明确报道。PLV侵染百香果后，感病植株主要表现为不明显的系统性花叶症状，老叶出现斑驳症状[18]。本研究通过RT-PCR方法检测到的PLV阳性检出率较高。究其原因可能有几点：(1)百香果原产自南美洲，贵州地区种植的品种均来自外地引种栽培，且繁殖方式主要以扦插或嫁接为主，无性繁殖方式容易积累病毒；(2)目前百香果的种植地集中分布南方地区，品种也比较单一，加上没有建立有效的脱毒体系，因此苗木容易带有病毒；(3)目前生产上缺乏对百香果病毒检疫和防范意识，引种时未考虑病毒检测，田间管理缺乏病毒病预防相关措施；(4)贵州百香果近些年发展快速，对苗木需求量大，苗木引种多从广西和福建等地引进，引种过程中容易受到病毒侵染。

本研究应用RT-PCR技术检测到贵州各地区侵染百香果病毒的情况，且病毒多以复合侵染为害百香果。因此，后期需要建立完善的脱毒体系，加强对百香果种苗的检测；同时提高百香果栽培管理水平，预防病毒病发生，从而保障百香果种苗健康生长，促进贵州百香果产业健康可持续发展。