长枝木霉菌肥对玉米生长、土壤肥力和根际微生物的影响

2022-06-09祝静于存

生物技术通报 2022年4期

祝静于存

（贵州大学林学院，贵阳 550025）

玉米（Zea mays L.）是世界上第一大粮食作物，富含蛋白质、维生素等多种营养物质。目前施用化肥是提高玉米生长和产量的主要方式，但长期施用化学肥料会降低土壤的理化性质，导致土壤养分含量不平衡，严重影响土壤环境［1］。随着微生物技术的不断突破，传统的化肥极有可能被微生物菌肥所代替，因为微生物菌肥对植物的生长发育、抗逆性等起到积极的作用，同时可以有效避免化学肥料应用后产生的一系列弊端［2］。以往已有多个关于利用微生物菌肥促进玉米生长的报道，但由于应用环境条件的差异，使其应用效果不理想［3-5］。因此，针对玉米开发高效的微生物菌肥，可以减少玉米栽培过程中无机化肥的用量，对玉米生物菌肥的开发和应用具有重要意义。

木霉（Trichoderma spp.）是一类广泛分布于自然界中的丝状菌物，木霉作为植物病害的生防菌已被人们所熟知［6］。此外，木霉还可以通过产生挥发性因子和生长素等类似物促进植物的生长、促进植物根系发育和提高作物产量。木霉凭借其生长速度快、无污染、对人畜无毒害等优点，在农业上被作为一种具有重要开发价值的微生物资源。微生物肥料作为一种新型肥料，既能发挥促生和抗病功能还能避免化肥和农药长期使用的一系列弊端［7］。以往有人通过将木霉制作为微生物肥料后作用于植物，以发挥其促生、抗病的功能。例如有研究利用哈茨木霉（T.harzianum）菌肥进行白菜（Brassica pekinensis L.）的增产试验，发现与传统的肥料相比，木霉菌肥处理具有操作简单且促生效果显著的优点［8］。

菌株1-cg-18是由闽楠（Phoebe bourne（Hemsl.）Yang）体内分离获得的一株具有较强溶磷、解钾、产IAA能力，同时还具有明显抗病效果的长枝木霉（T.longibrachiatum）［9］。前期研究中我们发现菌株1-cg-18菌液对玉米体现出了较好的促生效果。在此基础上，本研究通过检测长枝木霉菌肥对玉米幼苗生长、生理、土壤养分、土壤酶活性和根际土微生物群落的影响，揭示长枝木霉菌肥对玉米提质增效的效果及其作用机制，为玉米微生物肥料的开发和应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验所用土壤购买于什邡市绿源美家农业科技有限公司，其理化性质如下（pH 7.40、有机质含量399 g/kg、全氮7.76×104mg/kg，全磷含量0.09 g/kg，全钾为360 mg/kg），土壤经121℃高温高压灭菌60 min后备用。玉米种子采用惠玉788，购买自贵州友禾种业有限公司。长枝木霉（T.longibrachiatum 1-cg-18）菌种由贵州大学森林保护学科实验室提供，GenBank号为MK284517.1，PDA斜面菌种现保藏于该实验室4℃冰箱，所用化学肥料为尿素（含氮N：46%）。供试菌肥是按每克菌肥固态基质（酒糟∶麦麸=3∶7）添加1.0 mL蒸馏水，于121℃灭菌60 min后，每克菌肥固态基质接入0.3 mL的长枝木霉（106CFU/mL）菌液，于28℃恒温培养箱中培养7 d后获得长枝木霉菌肥，菌肥的孢子浓度为1010CFU/g。

1.2 方法

1.2.1 试验设计采用盆栽试验，共设置3个处理：（1）每克土加入0.01 g菌肥（YJ）；（2）0.07%化肥（YF）；（3）每克土加入0.01 g菌肥基质（YD）。选取籽粒饱满、大小均匀的玉米种子用5%的NaClO溶液进行种子消毒10 min后，用无菌水洗涤3-5次，每穴盆撒入5粒玉米种子（播种穴盆为上口12.5 cm、下口9 cm、高10 cm），每个处理设60盆苗，于2020年5月在贵州大学林学院温室内进行常规管理。通过肉眼观察各处理玉米高度上出现明显差异后，检测不同处理玉米的各项生长、生理、根际土养分、根际土酶活和根际土微生物群落。

1.2.2 指标测定玉米生长指标测定：不同处理玉米高度上产生明显差异后（40 d），每个处理随机选取不同处理组的10株幼苗利用直尺测定其苗高、根长；采用称重法测定玉米的鲜重和干重，其中干重是将玉米幼苗在105℃下烘干30 min，65℃烘干至恒量用电子天平称量。

玉米生理指标测定：在不同处理玉米40 d后，随机选取不同处理40株幼苗的叶片和根系，利用丙酮提取法测定叶片的叶绿素含量；采用考马斯亮蓝G-250法、蒽酮法测定玉米的可溶性蛋白和可溶性糖含量［10］；利用TTC法测定玉米的根系活力［11］；分别采用愈创木酚法、NBT还原法和高锰酸钾滴定容量法测定玉米的过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性［12］。生理指标测定至少3个重复。

玉米根际土养分含量和土壤酶活性测定：随机选取不同处理30株玉米幼苗，取出根系后轻轻抖落根系附着的外围土壤，然后用无菌毛刷刷下靠近根系4 mm范围内的土壤，将同一处理下10株幼苗根系土壤进行混合后作为一个重复，用于玉米根际土壤养分、土壤酶活的测定。其中土壤N、P、K的测定方法参考《土壤农化分析》［13］、土壤酶活性的测定方法参考《土壤酶及其研究方法》的方法［14］。

玉米根际土壤微生物群落测定：每个处理随机选取30株幼苗，每10株幼苗根际土作为1个重复。根际土收集方式同根际土养分和酶活性测定中收集方法。参考王元基［15］的方法对样本的基因组DNA进行提取，以土壤细菌总DNA为模板，应用通用引物 341F（5′-CCTACGGGNGGCWGCAG -3′）和 805R（5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC -3′）扩增16S rDNA的V3-V4区，扩增体系为25 μL；以土壤真菌总DNA为模板，应用引物ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和 ITS2R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）扩增真菌ITS1区，扩增体系为25 μL。委托贵州为莱科技有限责任公司采用IlluminaPE250对玉米根际细菌和根际真菌进行双端测序。其中真菌和细菌总DNA的PCR产物纯化回收、定量以及测序文库构建、文库质检等参考许来鹏等方法［16］。土壤微生物的生物信息学分析步骤如下：按照QIIME2 dada2分析流程，依次进行序列去噪、OTU聚类、物种分类。根据去噪和聚类结果，对每个序列做物种注释，选用STAMP、MetaStat、LEfSe、Anosim和MRPP等统计分析方法对分组样本的物种组成和群落结构进行差异显著性检验。

2 结果

2.1 长枝木霉菌肥对玉米生长的影响

长枝木霉菌肥对玉米幼苗生长指标的影响见表1。与对照（YD）相比，菌肥（YJ）和化肥（YF）处理均利于玉米的生长，且差异显著（P＜0.05）。其中，菌肥和化肥对玉米生长指标的影响差异不显著，且均呈现菌肥处理比化肥处理更利于玉米生长。其中菌肥处理的苗高、根长分别比对照处理高出了44.65%和75.74%；而化肥处理的苗高和根长比对照处理高出了39.87%和71.25%。此外，由干重和鲜重等生长指标也能发现类似的规律，如菌肥和化肥可有效提升玉米干重和鲜重（P＜0.05），但菌肥与化肥处理对比，两者对玉米地上干重和鲜重的影响差异不显著（P＞0.05）。另外，由图1也可直观的发现，不同处理对玉米生长影响的差异性。综合不同处理对玉米生长的影响，菌肥比化肥对玉米的促生作用更为明显。

图1 不同处理下玉米生长图Fig.1 Real growth map of maize under different treatments

表1 长枝木霉菌肥对玉米生长的影响Table 1 Effect of T.longissima fertilizer on maize growth

2.2 长枝木霉菌肥对玉米幼苗生理的影响

长枝木霉菌肥对玉米幼苗生理的影响如图2所示，与对照处理相比，菌肥和化肥处理均可提升玉米可溶性糖、可溶性蛋白、叶绿素含量、根系活力和3种保护酶活性，且均呈现菌肥处理效果优于化肥处理。菌肥和化肥对玉米生理指标影响中，除了可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、根系活力、地上CAT和POD的影响呈现差异显著外（P＜0.05），其他指标二者之间均差异不显著（P＞0.05）。其中，差异比较明显的是玉米可溶性糖含量，与对照相比，菌肥处理比对照处理的地上和地下的可溶性糖含量分别高出了 431.25% 和369.27%（P＜0.01），而化肥处理与对照处理之间的可溶性糖含量差异不显著（P＜0.05）。综合以上玉米生理指标发现，长枝木霉菌肥可以发挥出比化肥对玉米生理指标更好的促进作用。

图2 长枝木霉菌肥对玉米幼苗生理的影响Fig.2 Effects of T.longibrachiatum fertilizer on physiology of maize seedlings

2.3 长枝木霉菌肥对玉米根际土壤微环境的影响

2.3.1 长枝木霉菌肥对玉米根际土壤养分和根际土壤酶活性的影响由表2可知，菌肥处理和化肥处理均可提高玉米根际土氮、磷、钾的相对含量，二者与对照处理相比均差异显著（P＜0.05）。此外，菌肥处理对玉米根际土养分含量的影响要优于化肥处理，但二者之间差异不显著（P＞0.05）。其中菌肥和肥料对玉米根际土全磷、全钾、有效磷、速效钾、全氮和水解氮含量的提高幅度分别为38.04%和26.99%、29.81%和18.75%、52.60%和48.12%、14.21%和 8.74%、94.84%和 74.76%、24.00%和16.99%。

表2 长枝木霉菌肥对玉米根际土壤养分的影响Table 2 Effects of T.longibrachiatum fertilizer on soil nutrients in the rhizosphere of maize

由表3可知，菌肥和化肥处理对玉米根际土壤酶活性均有一定幅度的提高，但整体上菌肥处理对土壤酶活性的提高幅度要优于化肥处理。其中，菌肥处理对土壤脲酶和蔗糖酶的提高幅度更大，分别提高了37.04%和516.35%，而对磷酸酶的影响较小（P＞0.05）。化肥处理仅对蔗糖酶的提高幅度较高（405.97%）（P＜0.05），而对脲酶和磷酸酶的提升幅度较小（P＞0.05）。

表3 长枝木霉菌肥对玉米根际土壤酶活性的影响Table 3 Effects of T.longibrachiatum fertilizer on enzyme activities in maize rhizosphere soil

2.3.2 菌肥对玉米根际土微生物群落的影响菌肥处理对玉米根际土壤真菌和细菌数量的影响如图3所示，不同处理下玉米根际土细菌OTU数量远大于真菌的OTU数量。与对照处理相比，添加菌肥会减少土壤细菌OTU数量，但会增加土壤真菌OTU数量。添加肥料会增加根际土细菌OTU数量，但会减少真菌OTU数量。不同处理特有的细菌OTU数量排序为 YF（1 441个）＞YD（1 046个）＞YJ（981个）（图3-A）。特有真菌OTU数量排序为YJ（163个）＞YD（112个）＞YF（109个）（图3-B）。

图3 不同处理下玉米土壤微生物OTU数量韦恩图Fig.3 Wayne diagram of OTU number of maize soil microorganisms under different treatments

由表4可知，不同处理对细菌群落的Chao1丰富度指数、Shannon指数和ACE丰度指数影响的排序为：YF＞YD＞YJ。不同处理对土壤真菌群落的Chao1丰富度指数、Shannon指数和ACE丰度指数影响的排序为：YJ＞YD＞YF。以上结果表明，添加菌肥会增加根际土真菌多样性和丰富度，降低细菌多样性和丰富度；而添加化肥会增加细菌多样性和丰富度，减少根际真菌多样性和丰富度。

表4 各处理样本的微生物多样性指数Table 4 Microbial diversity index of each treatment sample

玉米幼苗根际土真菌和细菌门水平群落结构分析结果显示：在门水平上，3个处理真菌群落共有93个门，其top 3优势菌门分别是球囊菌门（Glomeromycota）、子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）（图4-A）。而细菌群落中共有112个门，其top 6优势菌门分别是变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）、疣微菌门（Verrucomicrobia）和芽单胞菌门（Gemmatimonadetes），相对丰度均大于1%以上（图4-B）。由Heatmap图和柱状图综合分析发现，在真菌门水平上，添加菌肥会使壶菌门（Chytridiomycota）和子囊菌门丰富度比例增加，但会使球囊菌门（Glomeromycota）和担子菌门（Basidiomycota）丰富度比例减少。而添加化肥会使担子菌门的相对丰度比例增加，但会降低子囊菌门和壶菌门（Chytridiomycota）的相对丰度（图4-C）。在细菌门水平上，添加菌肥会使变形菌门、芽单胞菌门、疣微菌门（Verrucomicrobia）丰度比例增加，但会降低软壁菌门（Tenericutes）和梭杆菌门（Fusobacteria）的相对丰度，而施加化肥会增加厚壁菌门和软壁菌门的相对丰度（图4-D）。

图4 各样本在门水平上的群落结构Fig.4 Community structure of each sample at phylum level

玉米幼苗根际土真菌属水平群落结构分析结果显示：在真菌属水平上，3个处理共包含181个真菌属，其中存在大量未经得到分类学注释以及未能辨认出的物种，已注释的物种主要为Trichocladium和Others，但二者在181个真菌属中所占比例较小（图5-A）。由Heatmap图可知，与YD和YF处理相比，施加菌肥可显著增加曲霉属（Aspergillus）、青霉属（Penicillium）、木霉属（Trichoderma）、灵芝属（Ganoderma）、单端孢属（Trichothecium）、古根菌属（Archaeorhizomyces）等属的丰富度；而施加化肥可显著增加鬼伞属（Coprinus）、毛壳属（Chaetomium）、蛇形虫草属（Ophiocordyceps）的相对丰度。分析不同处理对木霉属的影响，与对照处理相比，菌肥处理可以增加木霉属的相对丰度，而化肥处理会减少木霉属的相对丰度（图5-C）。

玉米幼苗根际土细菌属水平群落结构分析结果显示：在细菌属水平上，3个处理共有2 408个属，其优势属分别是苍白杆菌属（Ochrobactrum）、黄单胞菌属（Stenotrophomonas）、纤维弧菌属（Cellvibrio）、德沃斯氏菌属（Devosia）、鞘脂单胞菌属（Sphingopyxis）和土地杆菌属（Pedobacter）等22个属（图5-B）。由Heatmap图可知，与肥料和对照相比，施加菌肥能显著增加苍白杆菌属、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）和魏斯氏菌属（Weissella）等属的相对丰度，会显著降低棒状杆菌属（Corynebacterium）和普氏菌属（Prevotella）的相对丰度；而施加化肥可显著增加芽孢杆菌（Bacillus）、乳杆菌属（Lactobacillus）、噬氢菌属（Hydrogenophaga）和德沃斯氏菌属（Weissella）的相对丰度，但会降低梭菌属（Clostridium）、鞘氨醇单胞菌属和茎菌属（Caulobacter）的相对丰度（图5-D）。

图5 各样本在属水平上的群落结构Fig.5 Community structure of each sample at genus level

使用FUNGuild预测不同处理属水平上真菌群落的营养型和功能群，结果可被分为3个不同的营养型，分别为病原营养型、腐生营养型和共生营养型，3者所占比列分别为15.22%-26.25%、44.41%-70.00%和14.78%-28.94%（图6-A）。其中，与对照和肥料处理相比，添加菌肥会增加腐生营养型的相对丰度，降低共生营养型和病原营养型的相对丰度。加肥料会增加腐生营养型相对丰度，降低共生营养型和病原营养型的相对丰度。利用PICRUSt 2软件对不同处理玉米根际土壤属水平的细菌进行初步的功能预测。由图6-B可发现，3个处理内生细菌共包括氨基酸运输和代谢能源生产和转换、氨基酸转运与代谢、翻译、核糖体结构与生物发生、能源生产与转换、碳水化合物运输和代谢、细胞周期控制、细胞分裂及染色体分配等20类代谢通路。其中添加菌肥会提高能源生产与转换、无机离子转与代谢、脂质转运与代谢等代谢活动，而添加化肥会增加防御机制、复制、重组和修复和碳水化合物运输和代谢等代谢活动。

图6 不同处理土壤微生物功能预测Fig.6 Function prediction of soil fungi in different treatments

RDA分析又叫冗余分析，其用来阐明微生物群落与环境因子之间的关系。将不同处理玉米根际细菌和真菌属水平的种类与不同处理下土壤养分进行RDA分析，结果如图7所示，在真菌群落水平上，两主轴可以解释为3个处理土壤真菌群落总变异的69.75%，其中TK、TN、TP、AK、AP和HN均与菌肥处理组呈正相关，与肥料组和对照组均呈负相关。在细菌群落水平上，两主轴可以解释为3个处理土壤细菌群落总变异的33.51%，其中TN、TK、TP、AK、AP和HN与菌肥处理组均呈正相关，肥料处理与AK、TN、AP和TP呈正相关，与HN和TK呈负相关。

图7 玉米根际土壤微生物群落与土壤养分的RDA分析Fig.7 RDA analysis of soil microbial community and soil nutrients in maize rhizosphere

3 讨论

本研究通过盆栽试验检测长枝木霉菌肥对玉米幼苗的促生作用，结果显示，添加菌肥可以有效促进玉米的生长，并比化肥的促生效果更优。本研究中长枝木霉菌肥对玉米的促生效果显著高于吴云艳［17］利用生物菌肥对玉米的促生效果。与化肥处理相比，长枝木霉菌肥对玉米的生理具有更积极的作用。比如，菌肥处理显著提升了玉米根系活力，玉米根系活力的增加，可以菌增加根系对营养物质和水分的吸收，进而利于玉米的生长。同时，菌肥处理提高了玉米叶绿素含量，叶绿素含量的提升可有效促进植物光合作用的效率，这与郭成等［18］研究的长枝木霉可以提高玉米的光合作用结果相一致。此外，木霉菌肥处理提高了玉米可溶性糖和可溶性蛋白的含量，可溶性糖和可溶性蛋白的提升可以促进玉米体内脂肪、蛋白质等大分子物质合成，提高玉米细胞的保水能力。与杨春平等［19］研究绿色木霉L24处理可以提升玉米保护性酶活性的结果相似，本研究中木霉菌肥处理提升了玉米SOD、CAT、POD三种保护性酶活性。由此推断长枝木霉菌肥在促进玉米生长的同时还可以激活玉米自身的防御系统而增加其对环境及生物胁迫的的抵御能力。

微生物菌肥能够提高土壤透气度，增强土壤肥沃程度，进而促进植物生长［20］。本研究结果表明，与对照和肥料相比，长枝木霉菌肥对土壤养分和土壤酶活性的积极作用更优。分析菌肥改善土壤养分的原因可能是菌肥的施入产生了有机酸等类似物质，进而活化了土壤中难溶性的营养物质。土壤酶是土壤物质循环和能量流动的重要组成部分，土壤酶活性的增加可以促进根际土壤的代谢活动，作为土壤肥力的指标之一。在本研究中菌肥加入可以提高玉米根际土壤酶活性，其原因可能与土壤肥力水平、微生物种类和数量的差异有关［21］。

微生物多样性指数是评价微生物多样性的有效方法，且与土壤生态系统的稳定性密切相关。本研究中，菌肥处理增加了玉米根际土壤真菌群落的丰富度和多样性。而肥料处理增加了土壤细菌群落的多样性及丰富度，其原因可能是肥料中氮素的吸收与利用导致土壤中氮素下降，对细菌微生物的胁迫作用减弱，使微生物的活动和繁殖增加，从而使细菌微生物含量增多［22］。在门水平上，添加菌肥提高了变形菌门和子囊菌门的相对丰度，变形菌门可有效促进植物对氮、磷、钾元素的循环利用，利于玉米对土壤中的营养成分吸收利用，子囊菌门多为腐生真菌门，对降解土壤中有机质有重要作用。这与Pang等［23］运用长枝木霉处理番茄根系得到的结果相似。施加化肥会提高厚壁菌门和担子菌门相对丰度，担子菌门多为腐生菌门，可促进土壤物质循环，为土壤有益菌。在属水平上，添加菌肥提高了木霉属、曲霉属和苍白杆菌属的相对丰度，其中曲霉属和青霉属具有较强的溶磷作用，从而使磷元素的转化得到提高，提升土壤理化性质，是溶磷微生物的重要类群［24］。化肥的添加会使毛壳属显著增加，毛壳菌属以产生丰富的降解纤维素的酶和产生具有生理活性的次生代谢产物而著称，能对多种植物的多种病害的病原菌产生抑制作用［25］。

本研究中，腐生营养型为不同处理属水平上真菌群落的主要营养型，这可能与子囊菌门为优势菌门有关，子囊菌门多为腐生菌，是土壤中重要的分解者，可以分解难降解的有机质，在养分循环方面起着重要作用［26］。与对照组和肥料组相比，添加菌肥土壤的病原营养型相对丰度显著降低，病原营养型真菌主要从宿主获取营养来源，易造成植物病害。说明长枝木霉菌肥益于植株生长的同时，更有益于降低植株病害的发生。本研究将细菌、真菌属水平种类与土壤养分开展RDA分析，其中全钾为真菌群落最主要的影响因素，有效磷为细菌群落最主要的影响因素，且所有土壤养分含量均与菌肥处理呈正相关，说明菌肥能有效提高土壤养分含量，且对土壤真菌、细菌群落具有积极的影响。另外本研究在接种了长枝木霉菌肥后的育苗盆土壤表面可以观察到大量的绿色的木霉孢子的产生，同时由玉米根际土壤微生物群落的多样性的研究结果可知，长枝木霉可以有效定殖于根际土壤中。另外，以往多个木霉对不同植物的作用结果显示，大部分的木霉可以定殖于植物的根部［9，27］。由此，推测长枝木霉可以同时在玉米根际和根内发挥作用。综上，长枝木霉菌肥对玉米根际微生物群落的影响可能也是提升玉米根际土壤养分、促进玉米生长的重要原因。