娄彻氏链霉菌ZZ-9 与阿维菌素复配对南方根结线虫病的防治效果

黑雅娅，杨 树，张 欣，陈军宏，张 扬，薛应钰

（甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室·甘肃农业大学植物保护学院 兰州 730070）

阿维菌素是由土壤微生物阿维链霉菌的代谢产物研制而成的微生物源农药，近年来被广泛应用于农业生产，对防治根结线虫具有良好效果。长期单一使用阿维菌素等农药会使害虫产生抗药性，而盲目滥用农药也严重影响人类健康和农业绿色可持续发展。汤晗等对浙江省芹菜进行农药残留检测，94.7%的芹菜样品中有农药检出。韩明慧等研究发现新烟碱农药具有生殖毒性、肝毒性、神经毒性、遗传毒性和内分泌干扰效应，而且动物染毒剂量为mg·kg·d级别，高于一般人群µg·kg·d级别的暴露剂量。张巍等报道显示农药对环境的污染主要表现在大气污染、水体污染、土壤污染以及对生物的影响等方面。

近年来使用生防放线菌来防治植物病害已成为研究热点。放线菌是广泛分布于自然界中尤为重要的优势微生物类群，可以产生多种活性物质。链霉菌属是放线菌的一个主要类群，所产生的次级代谢产物结构种类多样，已经被广泛应用于农业生产中。胡栋等报道抗生素链霉菌（）菌株S205 对根结线虫的校正击倒率为92.90%，盆栽防效达到56.82%，且该菌在亚低温状态下依然能较好生长，抗性较强。周银丽等分离的壮观链霉菌（）菌株JS 1可以有效杀死南方根结线虫二龄幼虫、抑制线虫卵孵化。此外还有研究表明，微白黄链霉菌（）菌株发酵培养液对根结线虫具有明显的抑制作用，杀线活性为93.29%。由此可见，链霉菌可以产生多种防治根结线虫的活性物质，具有很高的研究价值。

本试验所用放线菌菌株为娄彻氏链霉菌（）ZZ-9，是由甘肃农业大学植物病害生物防治实验室分离的具有自主知识产权的生防菌株。主要研究了娄彻氏链霉菌（）ZZ-9 活菌液、发酵滤液的杀线活性以及菌株发酵液与阿维菌素以不同比例复配对南方根结线虫二龄幼虫的毒杀作用。以期通过本研究来减少化学农药的使用和延缓根结线虫抗药性产生，探索出一种新的方法来防治南方根结线虫病，对农业绿色可持续发展具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试生防菌株 娄彻氏链霉菌ZZ-9（专利保存号：CGMCC No.15245）由甘肃农业大学植物病害生物防治实验室分离保存。

1.1.2 供试植株和药剂 使用的番茄品种为秦蔬毛粉802，由西安秦蔬农业有限公司生产。供试药剂为1.8%阿维菌素乳油，由山东省绿士农药有限公司生产。

1.1.3 供试土壤 移栽病土于2017 年7 月采自甘肃省兰州市榆中县南方根结线虫发生较严重的番茄地块。选取每块田地的四角位置和中间位置为采集点，在植株周围选3 处不同位置用铁铲挖5～20 cm 处，每个位置取100 g 左右的土壤并去除肉眼可见较大的石块或者腐质，然后装至自封袋中混合均匀，带回实验室备用。

1.1.4 供试线虫 南方根结线虫二龄幼虫从上述土样中分离。

1992年10月，江泽民在党的十四大报告中提出：“夺取有中国特色社会主义事业的更大胜利”［3］210，在概念表述上，把“建设有中国特色的社会主义理论”表述成“建设有中国特色社会主义理论”，并从社会主义的发展道路、发展阶段、根本任务等九个方面对建设有中国特色社会主义理论的内容进行了全面概括。

1.1.5 培养基 高氏一号固体培养基、高氏一号液体培养基、小米浸汁培养基。

1.1.6 主要仪器 HZP-91R 恒温培养摇床，上海跃进医疗器械有限公司；VORTEX-5 漩涡混合器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；RQX-250 智能型人工气候箱，上海跃进医疗器械有限公司。

1.2 方法

1.2.1 南方根结线虫的繁殖和二龄幼虫的获得2019 年6 月在甘肃农业大学植物病害生物防治实验室采用盆栽感病番茄繁殖南方根结线虫。将番茄种子催芽后播种于采集的病土土样中，繁殖南方根结线虫，每盆种2 株番茄，共10 盆。35 d 后，将番茄根取出并用流水冲洗表面泥土，用镊子挑取根部卵囊于培养皿中，用0.5%次氯酸钠消毒3 min，再用无菌水反复冲洗3 次。将消毒后的卵囊置于灭菌的培养皿中，室温条件下孵化2 d，每隔24 h 用移液枪收集二龄幼虫于灭菌的三角瓶中，采用计数皿对二龄幼虫进行计数，并用无菌水将其配制成200 条·mL的线虫悬浮液，于4 ℃冰箱保存备用。1.2.2 ZZ-9 菌株活菌液的制备 将放线菌ZZ-9 采用划线法接种于高氏一号培养基上，于28 ℃倒置培养7 d。向150 mL 三角瓶中加入60 mL 高氏一号液体培养基，并将活化好的ZZ-9 菌株菌饼（直径5 mm）挑取到三角瓶中，每个三角瓶接6 个菌饼，28 ℃、180 r·min振荡培养72 h，制成种子液；按照10%的接种量将种子液接入到80 mL 的小米浸汁培养基中（150 mL 三角瓶），28 ℃、180 r·min振荡培养4d 后，即得活菌液。

1.2.3 ZZ-9 菌株发酵滤液的制备 将活菌液在4 ℃、10 000 r·min条件下离心20 min，取上清液，用0.22µm 微孔滤器过滤，即得无菌发酵滤液，存于4 ℃冰箱，备用。

1.2.4 阿维菌素溶液的制备 将1.8%阿维菌素乳油用无菌水分别配制成有效成分含量（，后同）为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0µg·mL的药液备用。

1.2.5 ZZ-9 菌株活菌液、发酵滤液杀线活性测定将ZZ-9 菌株活菌液和发酵滤液分别稀释5 倍、10倍、15 倍、20 倍后加入无菌24 孔细胞培养板（直径20.0 mm），每孔加入300 µL，再加入10 µL 线虫悬浮液（200 条·mL），以加入300µL 无菌水和10µL线虫悬浮液为对照，随机区组设计，每个处理3 次重复，密封后于25 ℃条件下保湿培养，每隔24 h 观察并记录线虫的死亡情况，计算死亡率、校正死亡率[19]。

1.2.6 ZZ-9 菌株发酵滤液与阿维菌素以不同比例复配的杀线活性测定 将ZZ-9 菌株发酵原液和5个浓度（，后同）梯度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0µg·mL）的阿维菌素溶液分别以1∶1、2∶1、3∶1 复配，利用混匀仪充分震荡使其混合均匀，每个处理3 次重复，随机区组设计。按照1.2.5 方法测定杀线活性。

1.3 线虫死亡情况的判断

采用“体态法”“挑针刺激法”和“NaOH 刺激法”判断线虫死亡情况。在光学显微镜下，观察不同条件处理后南方根结线虫二龄幼虫的存活情况。死亡的二龄幼虫虫体一般为僵直状态，存活的二龄幼虫虫体一般为弯曲状，且不断地游动。用挑针轻轻拨动虫体僵直的二龄幼虫，静止不动的即为死亡个体。最后1 次观察时向细胞培养板孔中滴入1%的NaOH 溶液，在显微镜下观察，静止不动的即为死亡个体。

1.4 数据处理

采用Excel 2016 和DPS 软件对数据进行统计分析，并用SPSS 16.0 软件计算LC，用Origin 9.0绘图。

2 结果与分析

2.1 ZZ-9 菌株活菌液、发酵滤液杀线活性测定结果

2.1.1 ZZ-9 菌株活菌液杀线活性测定结果 不同浓度的ZZ-9 菌株活菌液对南方根结线虫二龄幼虫均有明显的毒杀作用，其中活菌液原液对二龄幼虫毒杀效果最好，显著高于其他浓度处理，在48 h 时达到36.13%，24 h 时达到15%，且48 h 处理的校正死亡率总体均高于24 h；但随着稀释倍数的增加，不同浓度处理对二龄幼虫的毒杀作用不成规律性，这可能是由于菌液中的活菌体在各处理中分布不均导致的（图1）。

图1 ZZ-9 菌株活菌液对二龄幼虫的毒杀作用

2.1.2 ZZ-9 菌株发酵滤液杀线活性测定结果 通过不同浓度梯度的ZZ-9 菌株发酵滤液对根结线虫二龄幼虫的毒杀作用测定，可知在一定范围内，随着发酵滤液稀释倍数的增加，校正死亡率逐渐降低；且48 h 处理的校正死亡率总体均高于24 h 处理，南方根结线虫二龄幼虫的校正死亡率最高为11.87%，但48 h 时不同稀释倍数之间变化差异不显著；在24 h 时发酵滤液原液和稀释5 倍液对二龄幼虫的毒杀效果显著高于其他稀释倍数处理，但2 个时间处理均为发酵液原液表现出最强的杀线活性。因此，选择发酵滤液原液进行下一步试验（图2）。

图2 ZZ-9 菌株发酵滤液对二龄幼虫的毒杀作用

2.1.3 阿维菌素溶液对二龄幼虫的毒杀作用结果 由图3 可知，南方根结线虫二龄幼虫的校正死亡率随着阿维菌素溶液浓度的增大而逐渐升高，当浓度为1.0µg·mL时的杀线效果最好；且48 h 处理的校正死亡率总体均高于24 h 处理，最高达到30.60%；从图3 中可看出两个时间点都是浓度为

图3 阿维菌素溶液对二龄幼虫的毒杀作用

0.2µg·mL的校正死亡率显著低于其他浓度处理，当在24 h 时浓度为0.2µg·mL的校正死亡率比其他浓度处理分别低了10.82%、13.05%、13.58%和14.44%，48 h 时0.2 µg·mL的校正死亡率比1.0µg·mL低了19.59%。可见，作为市面上防治根结线虫的主要产品，阿维菌素对南方根结线虫二龄幼虫的防治较为理想。

2.2 发酵滤液与阿维菌素溶液不同比例复配杀线活性测定结果

2.2.1 发酵滤液与阿维菌素溶液1∶1 复配对二龄幼虫的毒杀作用 ZZ-9 菌株发酵滤液与阿维菌素溶液1∶1 复配后对二龄幼虫有较强的毒杀作用，随着阿维菌素溶液浓度的增大，复配溶液对二龄幼虫的毒杀效果也越好；而且48 h 处理的校正死亡率总体均高于24 h，其LC值分别为0.648 3µg·mL和1.399 2µg·mL；当阿维菌素浓度为0.2µg·mL时的校正死亡率分别为24.85%（48 h）和18.30%（24 h）显著低于其他浓度处理；此外，当阿维菌素浓度为1.0µg·mL时对二龄幼虫的毒杀效果最好，48 h 时二龄幼虫的校正死亡率为48.87%，比0.2 µg·mL高24.02%（图4）。

图4 ZZ-9 菌株发酵滤液与阿维菌素溶液1∶1 复配对南方根结线虫二龄幼虫的毒杀作用

2.2.2 发酵滤液与阿维菌素溶液2∶1 复配对二龄幼虫的毒杀作用 由图5 可知，ZZ-9 菌株发酵滤液与阿维菌素溶液2∶1 复配后对二龄幼虫有较强的毒杀作用，48 h 处理的校正死亡率总体均高于24 h，其LC值分别为1.417 6µg·mL和2.641 4µg·mL；当阿维菌素溶液浓度为1.0µg·mL时复配溶液对二龄幼虫的毒杀效果最好，48 h 时校正死亡率为39.10%，显著高于其他浓度处理，其中比0.2µg·mL高了29.72%。

图5 ZZ-9 菌株发酵滤液与阿维菌素溶液2∶1 复配对二龄幼虫的毒杀作用

2.2.3 发酵滤液与阿维菌素溶液3∶1 复配对二龄幼虫的毒杀作用 ZZ-9 菌株发酵滤液与阿维菌素溶液3∶1 复配后对二龄幼虫的毒杀效果显著。48 h时，随着溶液浓度的增大南方根结线虫的校正死亡率也逐渐增大；当阿维菌素浓度为1.0µg·mL时复配溶液对二龄幼虫的毒杀效果最好，校正死亡率分别为54.44%（48 h）和34.42%（24 h），显著高于其他浓度处理。其中，比0.2µg·mL分别高了53.35%和33.03%（图6）。此外，24 h 和48 h 的LC值分别为1.801 1µg·mL和0.964 0µg·mL。

图6 ZZ-9 菌株发酵滤液与阿维菌素溶液3∶1 复配对二龄幼虫的毒杀作用

2.2.4 不同溶液对二龄幼虫杀线活性比较 由图7可以得出，ZZ-9 菌株发酵滤液与阿维菌素溶液以不同比例复配后对二龄幼虫均有较强的毒杀作用。当发酵滤液与阿维菌素溶液（浓度为1.0µg·mL）以3∶1 复配时毒杀效果最好，处理48 h 时，二龄幼虫的校正死亡率高达54.44%，比单一使用阿维菌素的校正死亡率提高了23.84%，且药剂使用量仅有单一使用量的25%；2∶1 复配处理48 h 时，二龄幼虫的校正死亡率达39.10%，比单一使用阿维菌素高8.5%；1∶1 复配处理48 h 时校正死亡率为48.87%，比单一使用阿维菌素的校正死亡率高18.27%。

图7 不同溶液对二龄幼虫的杀线活性比较（阿维菌素浓度为1.0 mg·mL-1）

ZZ-9 菌株发酵滤液与阿维菌素溶液不同比例复配的杀线活性相比较没有表现出一定的规律性，但均高于单一使用发酵滤液原液（校正死亡率为11.87%）或单一使用阿维菌素（校正死亡率为30.60%）。可见，ZZ-9 菌株发酵滤液和阿维菌素溶液可以相互兼容，具有一定协同作用，复配使用有助于提高对南方根结线虫病的防治效果。

3 讨论与结论

随着蔬菜长期连作等现象的出现，根结线虫病的发生日益严重，制约着蔬菜产业的发展。生产上防控根结线虫主要以化学防治为主，具有高效、快速等特点，但是由于不合理的使用方法以及长期大量、单一的使用农药而造成了资源浪费和环境污染等问题，更直接影响了蔬菜的产量与品质。因此亟需探寻出一种新的方法来防治植物病害。

近年来生物防治已成为研究热点，链霉菌属生防放线菌对多种植物病害都有防治效果，但容易受环境条件的影响。而将生防菌与杀线剂复配可以弥补二者各自的不足，既可以增强生防菌防效的稳定性，充分发挥生防菌与杀线剂的协同作用，又可以减少农药的使用量，减缓线虫抗药性的产生。阿维菌素是目前防治根结线虫使用最多的药剂，张俊龙等研究结果显示，1.8%阿维菌素乳油对南方根结线虫表现出较好的室内活性，其LC值为14.926 3 mg·L。朱卫刚等试验结果表明, 1.8%阿维菌素乳油对南方根结线虫具有很强的杀线活性, 其LC为1.48 mg·L。而本研究结果显示当ZZ-9 菌株发酵滤液原液与1.8%阿维菌素乳油（浓度为1.0µg·mL）以3∶1 复配时对南方根结线虫病的防治作用较强，其LC为0.964µg·mL。可见生防菌ZZ-9 与阿维菌素有潜在的相容性，复配方案可以提高阿维菌素对根结线虫的防治效果。

大量研究表明生防菌与杀菌剂等药剂复配可以防治多种植物病害，并且能充分发挥二者间的协同作用。JI 等研究表明，枯草芽孢杆菌.DJ-6 与吡唑醚菌酯1∶1 配比时对草莓枯萎病抑制增效作用最大。赵广等研究证明枯草芽孢杆菌9 A 与嘧菌酯、咪鲜胺、吡唑醚菌酯、多菌灵复配可有效防治杧果炭疽病，其防效均显著高于单一化学农药处理及单一菌液处理，可以减少化学农药的使用量。毛雪琴等研究发现将生防菌MT-06 与甲霜锰锌混配可提高甲霜锰锌对小麦赤霉病的防效。还有研究表明，印楝素与5%阿维菌素复配施用，防治效果显著高于单一使用；其次，叶田会等研究结果显示，永卫168 与淡紫拟青霉联合施用的防效为75.83%，较单一处理的防效提高了23.75%～28.89%。笔者在研究中也发现将生防菌和药剂复配使用对南方根结线虫病的防效均高于单一使用阿维菌素及单一使用菌株发酵液，可见将生防菌与药剂复配可增强生防菌防效的稳定性，提高药剂的防治效果，这与前人研究结果相一致。因此，采用生防菌与药剂复配防治植物病害具有一定的可行性。

综上所述，本试验通过室内防效试验筛选出了最佳复配方案，当ZZ-9 菌株发酵滤液原液与阿维菌素（浓度为1.0µg·mL）以3∶1 复配时对南方根结线虫二龄幼虫的防治作用最强，48 h 时的校正死亡率为54.44%。试验结论初步发现将生防菌与农药复配可提高单一使用药剂或生防菌的防治效果，减少农药使用量，为娄彻氏链霉菌ZZ-9 的进一步开发利用提供了更广阔的思路，但其田间防效及实际推广应用还需进一步试验研究。