内生拮抗细菌264ZY7 的生物学特性测定及发酵条件优化

刘 华，冯中红，李统华，杨成德

（1.甘肃省经济作物技术推广站 兰州 730000； 2.甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室·甘肃农业大学植物保护学院 兰州 730070）

随着我国经济发展和人们生活水平的提高，对农业发展的追求已从单纯的高产转化为优质安全。化学农药的过量使用甚至滥用，造成了农药污染、农药残留、土壤多样性破坏和食品安全性降低等问题。于是生物防治成为近年来新的研究热点。生物防治具有高效无污染、无毒无公害等基本特点，不但与绿色食品的需求相符合，还可保障农业可持续发展。具有显著生防作用的内生细菌在大面积推广应用到田间前需制成生防菌剂，且该生防菌剂须具备生防物质活性高和存储时间长等特点，而发酵工艺的优化可提高拮抗菌株的生物量和活性，并降低生产成本。解淀粉芽孢杆菌中许多菌株能分泌抗菌物质、产生拮抗作用、营养与空间的竞争及诱导寄主产生抗性和促进植物生长等，是具有开发生物农药潜力的微生物。本试验中，解淀粉芽孢杆菌264ZY7 是一株从高寒草甸牧草中分离得到的内生细菌，对马铃薯炭疽病菌（）、马铃薯枯萎病菌（）、小麦根腐病菌（）、黄瓜枯萎病菌（.）、番茄灰霉病菌（）和马铃薯褐腐病菌（）等真菌和番茄细菌性斑点病菌（pv.）等细菌均有良好的拮抗作用。因此，2016 年在甘肃农业大学植物病原细菌及细菌多样性实验室对解淀粉芽孢杆菌264ZY7 的生长及促生特性进行测定，并结合单因素试验和正交设计试验对其高密度发酵培养条件进行优化，以期为菌株264ZY7 规模化生产、开发新型生防制剂奠定基础，并为进一步田间的小试和中试提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

解淀粉芽孢杆菌（）264ZY7 由甘肃农业大学植物保护学院植物病原细菌及细菌多样性实验室保存。

1.2 供试培养基

牛肉膏蛋白胨培养基NA 和培养液NB，PKO平板培养基和孟金娜平板培养基，阿须贝培养基。

1.3 生长及促生特性测定

1.3.1 生长温度测定 最低温度测定：将待测菌株于NA 斜面培养基上进行划线，分别置于温度梯度为0、2、4、6、8、10、12、14、16 ℃的恒温培养箱中培养24 h，观察其生长情况；3 次重复（每个重复样本数5 个，下同）。

最高温度测定：将待测菌株于NA 斜面培养基上进行划线，分别置于温度梯度为45、47、49、51、53、55、57、59、61 ℃的恒温培养箱中，培养24 h 后观察其生长情况；3 次重复。

致死温度测定：将待测菌株培养液接于装10 mL NB 培养液的试管中，分别经90、91、92、93、94、95、100、105、110 ℃的高温处理10 min 后，取0.1 mL 菌悬液均匀涂布于NA 平板上，并于28 ℃培养箱中培养，48 h 后观察并记录菌落生长情况；3次重复。

最适温度测定：取0.03 mL 待测菌株培养液接于装3 mL NB 培养液的试管中，以接无菌水培养液为对照，分别置于22、24、26、28、32、34、36 ℃的摇床培养（转速180 r·min），3 次重复，24 h 后测定OD值。

1.3.2 最适生长pH 测定 将NB 培养液初始pH用40%NaOH 和40%HCl 分别调为3、4、5、6、7、8、9、10 和11，取0.03 mL 待测菌株接于装有3 mL NB培养液的试管中，以无菌水培养液为对照，于28 ℃、180 r·min摇床中培养，3 次重复，12 h 后测定OD值。

1.3.3 生长曲线测定 取0.03 mL 待测菌株接于装有3 mL NB 培养液的试管中，以接无菌水培养液为对照，于28 ℃、180 r·min摇床中培养，3 次重复，前3 h 每隔30 min 检测一次OD值，3 h 后每隔1 h测一次。以OD值为纵坐标，以培养时间为横坐标，制作生长曲线。

1.3.4 生物学功能的研究 溶磷能力采用溶磷圈法，即将待测菌株分别点接在PKO 和孟金娜平板培养基上，同时，用无菌水点接作为对照，28 ℃培养3～5 d，菌落周围出现透亮溶磷圈的记录为阳性，否则为阴性；将待测菌株用划线法接于阿须贝培养基上，3 次重复，以接无菌水为对照，28 ℃培养，在第3天和第7 天检查其生长情况，在培养基上明显生长者记为阳性，继代培养3 代仍为阳性，则认为具有固氮能力；利用Salkowski 法测定产IAA 能力。

1.4 发酵条件优化

1.4.1 种子液制备 将已活化的新鲜待测菌株接于NA 培养液（100 mL·150 mL三角瓶）中，振荡培养（180 r·min，28 ℃）24 h，制得种子液。

1.4.2 碳、氮源及无机盐筛选 供试碳源：A 蔗糖；B 玉米淀粉；C 水溶性淀粉；D 麦芽糖；E 乳糖；F 不加糖；CK NB 培养基。将以上碳源分别替换基础培养液（40 mL·150 mL三角瓶）中葡萄糖，接入种子液2 mL，振荡培养（180 r·min，28 ℃）24 h，3 次重复，测定发酵液OD值，以OD值确定最佳碳源。

供试氮源：A 尿素；B（NH）SO；C KNO；D NHCl；E 酵母膏；F 不加氮；CK NB 培养液。将以上氮源分别替换基础培养基中蛋白胨，其他处理同碳源筛选，以确定最佳氮源。

无机盐：A MgSO；B KHPO；C MnSO；D Cu-SO；E CaCl；F 不加无机盐离子；CK NB 培养基。将以上无机盐分别替换基础培养基中NaCl，其他处理同碳源筛选，以确定无机盐。

1.4.3 正交试验设计 根据单因素试验筛选结果，将最适碳、氮源和无机盐按不同浓度进行L9（3）正交试验（表1），28 ℃，180 r·min摇床振荡培养24 h，通过检测发酵液OD值，分析方差显著性，确定最优培养基组合。

表1 L9（33）正交试验设计

1.4.4 摇瓶发酵条件优化 设定pH 为5、6、7、8、9，温度为20、24、28、32、36 ℃，摇床转速为150、180、210、240、270 r·min，接种量为0.5%、1%、2%、6%、10%，装液量为150 mL 三角瓶中分装20、40、60、80 和100 mL 培养液，3 次重复；在最佳培养基上分别振荡培养24 h，检测发酵液OD，筛选发酵条件。

1.4.5 100 L 发酵罐放罐时间确定 在最佳发酵培养基和培养条件下，对生防菌株进行连续培养，每隔3 h 取样，3 次重复，测定发酵液OD值，确定100 L 发酵罐中最佳放罐时间。

1.5 数据处理

利用Excel 2010 和SPSS 19.0 等软件进行试验设计与数据处理。

2 结果与分析

2.1 生长及促生测定

2.1.1 最低、最高、致死和最适生长温度的测定由图1 可知，菌株264ZY7 在温度低于2 ℃或高于55 ℃时不生长，在30～36 ℃时OD明显高于其他温度，在110 ℃水浴10 min 后涂于NA 平板上48 h后未发现菌落，表明菌株264ZY7 最高生长温度为55 ℃，最低、致死和最适温度分别为2 ℃、110 ℃和30～36 ℃。

图1 最适生长温度测定

2.1.2 生长pH 值测定 由图2 可知，pH 值在4 及以下时菌株264ZY7 生长明显受限，pH 值在5～7范围时生长良好，其OD高于其他pH 值，pH 超过8 时，菌株生长减缓，pH 值达到11 时菌株不生长。这表明菌株264ZY7 最适生长pH 值为5～7，低于4和高于8 不利于其生长。

图2 菌株264ZY7 最适生长pH

2.1.3 生长曲线测定 由图3 可知，菌株264ZY7在0～5 h 为迟缓期，在5 h 后进入对数生长期，14 h后进入稳定期，在30 h 时菌株生物量上升到最大值，之后进入衰退期（图3）。

图3 菌株264ZY7 生长曲线

2.1.4 促生能力表征测定 菌株264ZY7 在无氮阿须贝培养基上培养7 d 可以正常生长，且连续培养3 代均可形成明显菌落，说明菌株具有稳定的固氮能力；在溶磷培养基上不形成透明圈，说明无溶磷作用；在含色氨酸和不含色氨酸的培养液中分别加入比色液均表现为淡红色或血红色的阳性反应（图4），表明菌株有产IAA 的能力。

图4 产IAA 能力的定性测定

2.2 碳、氮源及无机盐筛选

2.2.1 碳、氮源及无机盐筛选 由图5 可以看出，菌株264ZY7 碳源为蔗糖时，OD显著大于其他碳源，即最适碳源为蔗糖。

图5 碳源对菌株264ZY7 生长的影响

由图6 可以看出，在酵母膏为氮源的培养基上OD显著高于其他氮源，说明酵母膏是最适氮源，尿素对该菌株有显著的抑制作用。

图6 氮源对菌株264ZY7 生长的影响

由图7 可以看出，CK（无机盐为NaCl）时发酵液OD显著高于其他无机盐，表明NaCl 是最佳无机盐，CuSO与MnSO对其有显著的抑制作用。

图7 无机盐对生防菌株264ZY7 生长的影响

2.2.2 碳、氮源及无机盐浓度优化 菌株264ZY7在碳源浓度（，后同）为蔗糖20 g·L时，OD显著大于其他碳源浓度，即最佳碳源浓度为蔗糖20 g·L；氮源酵母膏浓度为4 g·L时，OD显著大于其他氮源酵母膏浓度，即最佳氮源浓度为酵母膏4 g·L；无机盐浓度为NaCl 5 g·L时，OD显著大于其他NaCl 浓度，即最佳无机盐浓度为NaCl 5 g·L（图8、图9、图10）。

图8 碳源浓度对菌株264ZY7 生长的影响

图9 氮源浓度对菌株264ZY7 生长的影响

图10 无机盐离子浓度对菌株264ZY7 生长的影响

2.3 正交试验

由表2 正交试验可知，菌株264ZY7 在蔗糖25 g、NaCl 5 g、酵母膏5 g、水1000 mL 的培养液中OD显著大于其他正交试验，表明最适宜菌株264ZY7 生长为牛肉膏3 g、蔗糖25 g、NaCl 5 g、酵母膏5 g、水1000 mL。

表2 正交试验优化结果

2.4 摇瓶发酵条件的优化

2.4.1 最适pH 值筛选 由图11 可知，菌株264ZY7 在pH 6 时生长最快，且显著大于其他pH值下的OD，表明菌株264ZY7 生长的最适pH 值为6。

图11 pH 对菌株264ZY7 生长的影响

2.4.2 最适温度筛选 由图12 可知，菌株264ZY7在温度为28 ℃时OD最大，且显著大于其他温度下OD值，表明适宜菌株264ZY7 生长的最适温度为28 ℃。

图12 温度对菌株264ZY7 生长的影响

2.4.3 最佳接种量筛选 由图13 可知，菌株264ZY7 接种量为1%时OD最大，且显著高于其他接种量条件下的OD，表明该菌株生长最适的接种量为1%。

图13 接种量对菌株264ZY7 生长的影响

2.4.4 最佳装液量筛选 由图14 可知，菌株264ZY7 的装液量为40 mL·150 mL时OD显著高于其他装液量条件，即最佳装液量为40 mL·150 mL。

图14 装液量对菌株264ZY7 生长的影响

2.4.5 最佳转速筛选 由图15 可知，菌株264ZY7在摇床转速为240 r·min时OD达到最大，且显著高于其他转速时的生物量，表明该菌株生长最适的摇床转速为240 r·min。

图15 摇床转速对菌株264ZY7 生长的影响

2.4.6 100 L 发酵罐放罐时间确定 由图16 可知，在最佳摇瓶发酵条件下对菌株264ZY7 进行100 L发酵罐扩大培养，菌株264ZY7 在21 h 时OD极显著高于其他时间，表明菌株264ZY7 的发酵罐最佳放罐时间为21 h。

图16 发酵时间对菌株264ZY7 生长的影响

3 讨论与结论

高寒草甸内生细菌因其特殊的生境条件及抗逆性强等特点，是开发生防制剂的首选。王玉琴等从东祁连山高寒牧草中分离出内生细菌265ZY4 可有效抑制多种病原菌的生长，并且有固氮、溶磷和分泌IAA 等多种生物学功能。郭海等报道了高寒草地矮生嵩草内生细菌262AG6 对马铃薯炭疽病的抑制效果达到81.33%。笔者试验测定了菌株264ZY7 的固氮、溶磷、产IAA 能力及最低、最高、致死、最适生长温度、pH 和生长曲线。结果表明，菌株264ZY7 具有稳定的固氮和产IAA 能力，最高生长温度55 ℃、最低生长温度2 ℃、致死温度110 ℃、最适温度30～36 ℃，最适pH 值5～7。致死温度110 ℃，比杨冬静等报道的解淀粉芽孢杆菌的致死温度（100 ℃）高，表明菌株264ZY7 更耐受加工制备成生防制剂过程中的高温等条件；与张娟等报道的解淀粉芽孢杆菌pH 为中性的结论基本一致。生长曲线表明，在5 h 进入对数生长期，在10～14 h 时进入稳定生长期，与王卉等报道的解淀粉芽孢杆菌L-S60 在10 h 进入对数生长期、在20 h 时进入稳定生长期的结果相比培养时间极度缩短，表明菌株264ZY7 能在较短的时间内培养出高密度的生物量，在病害防治中所需时间缩短，能方便快捷的运用于生产中。

对生防内生细菌发酵条件优化有利于菌株的培养和用于生产中。冯中红等对抗马铃薯坏疽病的莫海威芽孢杆菌ZA1 培养条件的优化得到最佳培养基配比氯化铵14.25 g、玉米粉19 g、马铃薯237 g、水1000 mL，最佳发酵条件pH 7.7、培养温度28 ℃、转速180 r·min及发酵时间36 h，ZA1 优化后活菌数为4.12×10CFU·mL。本试验中菌株264ZY7 对多种病原真菌和番茄丁香假单胞叶斑病菌都有较强的抑制效果，为了使其较快的进入工业化生产并应用到田间地头，试验通过单因素和正交设计试验优化了其发酵工艺。结果表明，菌株264ZY7 的最优培养基配比及生长条件为：牛肉膏3 g，蔗糖25 g，NaCl 5 g，酵母膏5 g，水1000 mL；温度为28 ℃；接种量为1%；装液量为40 mL·150 mL；摇床转速为240 r·min；pH 6；100 L 发酵罐放罐时间为21 h。与刘京兰报道的内生解淀粉芽孢杆菌优化后的发酵条件为pH 6，发酵温度28 ℃等的结论接近，最佳接菌量比7%少。与李鑫等报道的解淀粉芽孢杆菌HRH-317 优化后的发酵条件pH 7，最佳接菌量3.8%、最佳时间21 h，最适温度37 ℃相比，最佳接种量少，最适温度低于李鑫等报道的解淀粉芽孢杆菌HRH-317 的最适温度且更近于常温，比梁艳琼等和洪鹏等报道的解淀粉芽孢杆菌的最佳接种时间48 h 短，表明本试验中的生防菌能在较低要求的培养条件下获得较多的有益产物，且此差异的出现也可能由菌株的来源不同所致。经过发酵工艺的优化，菌株264ZY7 的生物量显著高于优化前（发酵前最高的OD1.69，发酵后的OD10.37），该结论为菌株264ZY7 进入工业化生产奠定了良好的基础。但菌株264ZY7 的抑菌物质及在番茄根、茎、叶内的定殖动态尚不明确，此还有待于进一步研究探讨。

内生拮抗细菌264ZY7 具有稳定的固氮和产IAA 能力，在牛肉膏3 g、蔗糖25 g、NaCl 5 g 和酵母膏5 g，水补足至1000 mL 和pH 6 的培养基中，于28 ℃、接种量1%、装液量40 mL·150 mL和转速240 r·min条件下发酵21 h 的OD达10.37。该研究结果为利用内生拮抗细菌264ZY7 开发生防制剂奠定了基础。