SD大鼠原代海马神经元的一种优化培养方法

强婷婷，胡宪文，张 丽

(安徽医科大学第二附属医院麻醉与围术期医学科，麻醉与围术期医学安徽普通高校重点实验室，安徽 合肥 230601)

体外培养的海马神经元是研究中枢系统神经发育及神经精神疾病发病机制的重要细胞模型[1]，该模型具有培养条件易控、机体复杂因素干扰少、结果易分析等优势。目前应用比较广泛的培养方法是利用含10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的DMEM/F12培养基进行神经元培养[2-4]。但是，利用10% FBS培养出来的海马神经元混杂了很多胶质细胞，常需要加入有丝分裂抑制剂如阿糖胞苷、5-氟-2′脱氧尿苷(5-Fluoro-2-deoxyuridine，FUDR)[5-6]抑制胶质细胞的生长。然而，有丝分裂抑制剂的使用在一定程度上会抑制神经元生长和分化。因此，本研究提出一种全程无血清的培养方法，并比较无血清培养、FBS培养和FBS+FUDR培养这3种方法培养出来的神经元的生长状态和纯度，为培养出活力好、纯度高的原代海马神经元提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 孕(18±1)d SD大鼠由安徽医科大学动物实验中心提供，生产许可证编号：SCXK(皖)2017-001。

1.1.2主要器械与试剂耗材 小动物手术器械一套，不同规格的玻璃皿一套，高压蒸汽灭菌及烘干后使用。60 mm培养皿、24孔板、96孔板(CORNING公司，美国)；DMEM/F12培养基、谷胱甘肽(Glutamax)、青-链霉素、0.25%胰蛋白酶-EDTA、B-27、Neurobasal培养基(Gibco公司，美国)；5-氟-2′脱氧尿苷、多聚-L-赖氨酸(Poly-L-lysine，PLL)、巯基乙醇、腐胺、硒、胰岛素、黄体酮(Sigma公司，美国)；FBS(Lonsera公司，乌拉圭)；葡萄糖、抗荧光淬灭封片液、CCK-8检测试剂盒、TUNEL凋亡试剂盒(碧云天生物技术公司，北京)；正常山羊血清、TritonX-100(索莱宝科技有限公司，北京)；微管结合蛋白2(MAP2)抗体、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)小鼠单克隆抗体(CST公司，美国)；Goat Anti-Rabbit IgG、Goat Anti-Mouse IgG(Thermo公司，美国)。

1.1.3主要仪器设备 CO2细胞培养箱、多功能酶标仪、超净工作台(Thermo公司，美国)，倒置相差荧光显微镜(OLYMPUS公司，日本)。

1.2 方法

1.2.1溶液配制 (1)PLL工作液：25 mg PLL冻干粉剂溶于灭菌后的超纯水中，配成0.1 g·L-1，经0.22 μm无菌滤器过滤后分装备用。(2)FUDR：100 mg溶于100 mL无菌超纯水中，配成1 g·L-1，经0.22 μm无菌滤器过滤后分装，避光保存。(3)激素混合剂(hormone cocktail，HC)4 mL：25%胰岛素(5 kg·L-1)+0.125%黄体酮(1.256 g·L-1)+12.5%腐胺(32.2 g·L-1)+0.25%硒(0.52 g·L-1)+62.125%纯水。(4)Neurobasal细胞种植液100 mL：94.5% Neurobasal+1%青-链霉素+1%Glutamax+1%葡萄糖(30%)+2%B-27+0.4% HC+0.1% β-巯基乙醇。(5)DMEM/F12细胞种植液100 mL：88% DMEM/F12+10% FBS+1%青-链霉素+1% Glutamax。(6)Neurobasal细胞维持液100 mL：96% Neurobasal+2% B-27+1%青-链霉素+1% Glutamax。

1.2.2实验分组 无血清培养组(Serum-free组)：Neurobasal细胞种植液，12 h后换成Neurobasal细胞维持液；胎牛血清培养组(FBS组)：DMEM/F12细胞种植液，12 h后换成Neurobasal细胞维持液；胎牛血清+5-氟-2′脱氧尿苷培养组(FBS+FUDR组)：DMEM/F12细胞种植液，12 h后换成Neurobasal细胞维持液，培养至d 3时加入50 μmol·L-1FUDR。

1.2.3细胞培养皿及培养板准备 眼科镊紫外线消毒以后将细胞培养专用爬片(直径14 mm)放置于24孔板中，按照200 μL·cm-2的剂量滴加PLL。若直接将细胞种在60 mm培养皿或者96孔板中则滴加PLL为150 μL·cm-2。包被5 min后用无菌的超纯水清洗3遍，超净台晾干后待用。

1.2.4SD大鼠胎鼠海马神经元培养 (1)取材：取孕(18±1)d SD大鼠，根据文献[7]方法，七氟烷麻醉孕鼠，用75%酒精消毒孕鼠腹部，“V”字形剪开腹部，快速取出胚胎置于培养皿内，然后迅速将胎鼠断头取脑，放入装有预冷的PBS缓冲液的培养皿中，解剖显微镜下分离海马组织，仔细剥离血管膜后将完整的海马组织置于PBS缓冲液中。(2)消化及离心：在生物安全柜中将海马组织转移到15 mL离心管中，弃掉上层的PBS，然后加入2 mL 0.25%胰酶(37 ℃预热)消化液，用1 mL移液枪吹散组织后再把组织胰酶混合液转移到60 mm培养皿，放在37 ℃培养箱内消化10 min。消化结束后用10% FBS等体积中和胰酶(即为中和液)，用1 mL枪头轻轻吹打30次，然后等体积分成两部分，将含海马细胞的两份中和液置于离心机中，1 200 r·min-1，离心5 min，弃去中和液，分别加入适量Neurobasal细胞种植液和DMEM/F12细胞种植液，轻柔吹打1 min，重新悬浮细胞并使之变成单细胞悬液。(3)细胞计数及接种：取10 μL单细胞悬液，滴加在红细胞计数板上计数，调整接种密度为(2～3)×108个·L-1，14 mm细胞爬片种植400 μL细胞悬液，60 mm培养皿种植3 mL细胞悬液，96孔板种植150 μL细胞悬液，放入CO2细胞培养箱中培养。(4)换液及纯化：培养12 h后，全量换液为Neurobasal细胞维持液。培养d 3后，半量换液，FUDR培养组加入50 μmol·L-1FUDR。每隔3 d更换一次细胞培养液，半量换液。

1.2.5形态学观察 分别在d 1、d 3、d 5、d 7、d 9、d 13、d 17、d 21时间点于倒置显微镜明场下观察海马神经元的细胞形态并拍照。

1.2.6CCK-8检测细胞活力 观察1～21 d 3组海马神经元细胞的活力，每组设10个复孔。将细胞悬液调整密度后种植于96孔板内，每孔100 μL细胞悬液，约3万个细胞。于不同时间点弃去96孔板中的培养基，重新加入Neurobasal细胞维持液，100 μL/孔。再加入10 μL/孔CCK-8溶液，放入CO2细胞培养箱中孵育2 h。酶标仪测定450 nm处的吸光度(OD值)。

1.2.7TUNEL染色检测细胞凋亡 培养至d 7的神经元，弃去培养基，加入4%多聚甲醛固定细胞30 min，PBS洗1次，再加入0.3% Triton X-100室温通透细胞5 min，加入50 μL/孔TUNEL检测液，37 ℃避光孵育1 h，PBS洗3次，滴加抗荧光淬灭封片液，置于荧光显微镜下观察，每组选取5个视野计算细胞凋亡比例。

1.2.8免疫荧光检测细胞纯度 培养至d 7的神经元，弃去培养基，加入4%多聚甲醛，室温下固定细胞15 min，PBS洗3遍，每次5 min。每孔加入0.3% TritonX-100，室温下通透10 min，PBS漂洗3次。每孔加入5%正常山羊血清，37 ℃下封闭40 min。弃去封闭缓冲液，然后每孔加入稀释后的一抗(稀释比MAP2 1 ∶50，GFAP 1 ∶300)，4 ℃过夜，PBS洗3次。用眼科镊取出细胞爬片置于24孔板盖子上，滴加混有山羊抗兔、山羊抗鼠的二抗(稀释比均为1 ∶1 000)，室温避光孵育1 h，PBS洗3次。在玻片上滴加4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)，用镊子夹起爬片反扣于载玻片上，避光存放于湿盒中。在荧光显微镜下观察并拍照。红色荧光为MAP2阳性细胞(海马神经元)，绿色荧光为GFAP阳性细胞(胶质细胞)，蓝色荧光为DAPI染色(细胞核)。神经元纯度计算方法：MAP2阳性细胞数/DAPI核染色细胞数×100%。每次细胞计数时随机选取5个视野(显微镜下100倍视野范围)，取平均值。

2 结果

2.1 原代海马神经元的形态学特点初培养时，细胞密度均匀大小一致，悬浮在培养基中，外观呈圆球状，胞体透亮。培养至5 h后，绝大部分细胞已贴壁并且分布均匀，细胞呈类球形，略不规则，胞体透亮度明显减低，稍有立体感，其中极少数细胞开始长出轴突和树突。培养至24 h后，细胞完全贴壁，大部分细胞长出突起，多为双极和多极细胞。此时细胞胞体呈类球形、椭圆形、漏斗形，胞体周围出现光晕，细胞立体感增强。培养至d 3后，细胞胞体增大，突起增多变长甚至出现明显分支。海马神经元细胞开始出现聚集生长现象。培养至d 5后，细胞进一步聚集生长，并且细胞之间突起交织成网状。培养至d 7～9，神经元成熟，胞体饱满且周围存在光晕，细胞突起形成丰富致密的网络，但难以辨认突起起源。培养至d 13突起形成的网络密集且粗壮，大部分细胞内部出现空泡。培养至d 17～21，细胞明显开始衰老，部分胞体皱缩变小，甚至裂解死亡(Fig 1)。

Fig 1 The growth status of primary SD rat hippocampal neurons at different culture time points (Scale bar=50 μm)

2.2 不同培养方法培养时的海马细胞生长曲线如Fig 2所示，比较3种培养方式下海马神经元在d 1～21各个时间点的细胞活力。与FBS组相比，Serum-free组在d 8～21时细胞活力较高，表明无血清培养方法培养出来的海马神经元更加稳定，差异有统计学意义(P<0.05，Fig 2)。FBS+FUDR组在细胞培养至d 3时加入FUDR，与FBS组相比，加入FUDR 48 h以后细胞活力明显降低(P<0.05，Fig 2)，并且d 5～21的神经元的细胞活力一直低于FBS组(P<0.05，Fig 2)。

Fig 2 The continuous growth curve of hippocampal neurons detected by CCK-8

2.3 细胞凋亡比例如图3所示，FBS+FUDR组与FBS组相比，细胞凋亡比例增加，表明FUDR可以促进细胞凋亡(P<0.05，Fig 3)。Serum-free组与FBS组相比，细胞凋亡率差异无统计学意义。

Fig 3 Cell apoptosis detected with TUNEL staining (400×，Scale bar=20 μm)

2.4 免疫荧光染色下神经元纯度的鉴定相同种植密度下，Serum-free组MAP2阳性细胞比例高于FBS组(P<0.05，Fig 4，Tab 1)和FBS+FUDR组(P<0.05，Fig 4，Tab 1)，并且GFAP阳性细胞比例比FBS组和FBS+FUDR组低(P<0.05，Fig 4，Tab 1)。FBS+FUDR组与FBS组相比，GFAP阳性细胞比例降低(P<0.05，Fig 4，Tab 1)，表明细胞培养至d 3时加入FUDR可以抑制胶质细胞生长，提高神经元纯度。

Tab 1 Purity of hippocampal neurons cultured by different methods

Fig 4 MAP2 and GFAP immunofluorescence co-staining (Merge2 group picture was×400，Scale bar=20 μm;the rest was×100，Scale bar=100 μm)

3 讨论

海马是神经认知领域研究的一个重要脑区。原代海马神经元直接取材于动物的海马组织，相对于细胞系能更好的模拟动物体内细胞，然而海马神经元在体外不易存活，选择合适的培养条件是神经元培养成功的关键因素之一。因此，如何获得高纯度、高活性、生存时间较长的原代海马神经元，是一项值得深入研究的课题。本研究提出一种原代神经元培养的无血清的优化培养方案：以Neurobasal培养基为主，用B-27代替血清，Glutamax代替L-谷氨酰胺的优化配方来培养神经元。

为了促进神经元的贴壁和生长，以往的研究多在原代培养过程中使用了含有10%FBS的DMEM/F12培养基，但是FBS为神经元生长提供营养的同时也会刺激胶质细胞迅速生长[8]。本研究发现FBS组胶质细胞(GFAP阳性细胞)比例达到了10.4%，远高于Serum-free组。在体外环境下，胶质细胞会释放细胞毒性因子，促进神经细胞凋亡[5]。有研究提出在培养神经元过程中使用抗有丝分裂剂FUDR来降低胶质细胞比例，因为FUDR可通过减少非神经元细胞S期DNA合成的数量，来发挥抑制胶质细胞生长的作用[9-10]。然而本研究发现，在细胞生长至d 3后，即使按照FUDR的最低有效剂量(50 μmol·L-1)[11]使用也会给神经元带来持续性损伤。经实验发现，加入FUDR后神经元的细胞活力始终低于未加FUDR的FBS组。TUNEL染色结果也显示，FBS+FUDR组的细胞凋亡率高于FBS组。因此，含有FBS的DMEM/F12培养基或者其中再加入了FUDR的培养基都不是最佳的原代神经元培养方案。

本研究采用无血清培养配方(Neurobasal+B-27)，其中B-27是非常理想的添加剂，能够代替血清为神经细胞生长提供必需的神经因子。实验结果显示，无血清培养可以使神经元胶质细胞比例降低至3.5%，并且d 8～21培养的神经元活性显著优于FBS组，证明无血清培养方案既能促进神经元的存活和生长，还能有效抑制非神经元的分裂增殖。神经元在培养12 h后(神经元完全贴壁而胶质细胞和细胞碎片未完全贴壁时)全部换液至Neurobasal维持液中生长，可以进一步降低胶质细胞比例。此外，优化方案中补充了少量细胞生长刺激物(包含硒、腐胺、胰岛素、黄体酮)促进神经元生长，同时还添加了少量的 β-巯基乙醇能够清除细胞生长过程中释放的氧自由基，最大程度上降低血清减少带来的不利影响。谷氨酰胺是细胞培养过程中产生能量和蛋白质合成所必需的氨基酸。然而，细胞培养液中的L-谷氨酰胺随着时间的推移会自发降解生成氨，会影响蛋白质糖基化，降低蛋白质产量，降低细胞活力[12]。与L-谷氨酰胺不同，Glutamax添加剂不会自发分解，因此不会形成氨。相反，加入Glutamax后细胞会根据需要裂解二肽键以释放L-谷氨酰胺[13]。因此无血清配方中使用Glutamax作为L-谷氨酰胺的直接替代品。这样既可以防止氨的积累又在长期培养过程中维持了L-谷氨酰胺的新鲜供应。

综上，从3种培养方案各自的SD大鼠胎鼠原代海马神经元的培养结果来看，全程以Neurobasal+B-27培养基为主的无血清培养方法可以在短时间内获得纯度更高、活力更好的神经元，是建立体外海马神经元原代培养模型的一种优化方法。