大豆异黄酮通过NF-κB p65信号通路抑制Aβ1-42诱导的海马神经元炎症和凋亡

邵晓洁，管文婕，洪占梅，陈 明，王 凡，吕东来，3，张旭东

(1. 中国人民解放军联勤保障部队第九〇一医院药剂科，安徽 合肥 230031；2.安徽医科大学基础医学院药理学教研室，安徽 合肥 230032；3. 陆军军医大学西南癌症中心，重庆 400038)

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1动物 SPF级，♂，新生24 h SD大鼠，体质量(6.02 ± 0.01)g，购买于上海斯莱克实验动物有限公司，SCXK(沪)2018-0002，饲养于安徽医科大学实验动物学部，SYXK(皖)2020-0019。

1.1.2药物与试剂 大豆异黄酮(华北制药股份有限公司，批号：060104)；Aβ1-42[翌圣生物科技(上海)股份有限公司，货号：20602ES03]；DMEM/F12培养基(Gibco公司，货号：C11330500BT)；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(上海慧颖生物科技有限公司，货号：FB15015)；二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO，济南世纪通达化工有限公司，货号：CAS67-68-5 ) MTT检测试剂盒(上海生工生物工程有限公司，货号：E606334)；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，货号：CA1020)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术，货号：P0012S)；显影定影试剂盒(上海碧云天生物技术，货号：P0019)；山羊抗兔(上海碧云天生物技术，货号：A0408)；山羊抗小鼠(上海碧云天生物技术，货号：A0412)；一抗稀释液(上海碧云天生物技术，货号：P0256)；二抗稀释液(上海碧云天生物技术，货号：P0258)；环氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)一抗(Cell Signaling Technology，货号；4842)；TNF-ɑ一抗(Cell Signaling Technology，货号；8643)；IκBα一抗(Santa Cruz Biotechnology，货号：sc-52900)；p-IκBα一抗(Santa Cruz Biotechnology，货号：sc-8404)；NF-κB p65一抗(Santa Cruz Biotechnology，货号：sc-8008)；p-NF-κB p65一抗(Santa Cruz Biotechnology，货号：sc-398442)；cleaved-caspase-3一抗(Cell Signaling Technology，货号：9664)；Bcl-2一抗(Cell Signaling Technology，货号：15071)；β-actin一抗(上海碧云天生物技术，货号：AF5001)。

1.1.3主要仪器 TWK-FST32型组织匀浆仪(武汉泰普拓科技有限公司)；Micro17R型高速冷冻离心机(离心半径：6 cm)、FC型全自动多功能酶标检测仪[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]；GPJ9-TS100-F型倒置荧光显微镜(日本Nikon公司)；1658033型电泳仪、ChemiDoc XRS+成像系统(美国Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1大鼠海马神经元原代培养与鉴定 新生24 h大鼠采用酒精消毒、断头处理，并在无菌条件下取出大脑并分离海马组织；海马组织剪碎并加入0.25%的胰蛋白酶消化30 min；加入DEME/F12培养基终止消化，将细胞悬液放置离心机内，设置转速度1 200 r·min-1离心5 min，静置2 min后吸去上清液，加入新鲜的细胞培养基吹打并将其悬液过200目筛网进行过滤，调整好细胞浓度并接种至经过L-多聚赖氨酸处理后6孔板内，放置于37 ℃，5% CO2细胞培养箱内常规培养48 h；加入5 g·L-1阿糖胞苷抑制非神经细胞活性。期间每3 d对原细胞培养基进行1/2体积更换。海马神经元培养10 d，采用免疫荧光染色法鉴定神经元，神经元神经丝蛋白(NF)2000抗体结合山羊抗兔免疫荧光二抗荧光染色鉴定。

1.2.2海马神经元分组与给药处理 实验分为对照组(Control)、Aβ1-42处理组、SI低、中、高给药浓度组。其中Cotrol组与含有10% FBS的DMEM/F12培养基共培养48 h；Aβ1-42处理组海马神经元加入30 μmol·L-1的Aβ1-42处理48 h；SI低、中、高剂量组(SI-L、SI-M、SI-H)海马神经元首先分别加入终浓度10、20和40 mg·L-1的SI预处理2 h，然后加入30 μmol·L-1的Aβ1-42处理48 h。

1.2.3MTT检测海马神经元存活率 大鼠海马神经元原代细胞按照96孔板密度为：1×107·L-1密度接种，按照实验分组进行对应处理，培养48 h，每组设置6个复孔，重复实验3次，每孔加入MTT溶液10 μL(5 g·L-1)继续培养4 h，终止培养，弃去细胞上清，每孔加入150 μL的DMSO震荡10 min，使得充分溶解，酶标仪设定波长为570 nm检测各孔的吸光度值，以光密度(optical density，OD)值反映海马神经元活力。海马神经元存活率/%=各处理组细胞OD/对照组OD值×100%。

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1.2.4TUNEL染色检测海马神经元凋亡率 海马神经元按照1×107·L-1密度接种于12孔板内，按照TUNEL染色检测试剂盒进行海马神经元凋亡检测。于200倍光学显微镜下随机性选取3个视野观察各组海马神经元凋亡情况。TUNEL阳性细胞(凋亡细胞)染色呈棕色。海马神经元凋亡率/%=TUNEL阳性细胞数目/总细胞数目×100%。

1.2.5Western blot检测海马神经元相关蛋白表达 海马神经元加入细胞裂解液后于冰上裂解40 min；4 ℃，12 000 r·min-1，离心10 min，吸取细胞上清液；BCA法测定各组海马神经元蛋白质浓度；上样(按照每孔上样量30 μg计算得出上样体积)；凝胶电泳(80 V，30 min后120 V，60 min)；湿转法转膜90 min；5%脱脂牛奶室温封闭2 h；分别加COX-2一抗(1 ∶1 000)、TNF-ɑ一抗(1 ∶1 000)、IκBα一抗(1 ∶1 000)、p-IκBα一抗(1 ∶1 000)、NF-κB p65一抗(1 ∶1000)、p-NF-κB p65一抗(1 ∶1 000)及β-actin抗体(1 ∶2 000)，4 ℃孵育过夜；加对应的山羊抗兔二抗或者山羊抗鼠二抗(1 ∶5 000)，室温孵育1～2 h；加吐温20磷酸盐缓冲溶液洗涤3次，每次5 min，加入显影液，显影并拍照。以目的蛋白条带灰度值与β-actin条带灰度值的比值反映目的蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 原代海马神经元培养与鉴定光学显微镜下观察海马神经元生长情况。10 d可见海马神经元之间的突起形成网状，胞体呈锥体状和纺锤状，伴有长轴突和树突形成。荧光显微镜下观察神经元NF200染色呈红色，细胞核染色呈蓝色，大约90%以上呈NF200阳性，表明原代海马神经元培养与鉴定获得成功(Fig 1)。

Fig 1 Culture and identification of primary hippocampal neurons (200×)

2.2 各组海马神经元存活率情况MTT检测显示，与Control组相比，Model组海马神经元存活率明显降低(P<0.01)。与Model组相比，SI-L、SI-M、SI-H组海马神经元存活率明显升高(P<0.05或P<0.01)(Fig 2)。

Fig 2 Comparison of survival rate of

2.3 SI对Aβ1-42诱导海马神经元炎症因子表达的影响Western blot检测海马神经元COX-2和TNF-ɑ蛋白表达水平。结果显示，与Control相比，Model组细胞TNF-ɑ和COX-2蛋白表达明显升高(P<0.05或P<0.01)。与Model组相比，SI-H组细胞TNF-ɑ和COX-2蛋白表达明显降低(P<0.05或P<0.01)(Fig 3)。

Fig 3 The expression levels of TNF-ɑ andCOX-2 in hippocampal neurons n=3)

2.4 SI对Aβ1-42诱导海马神经元凋亡的影响TUNEL染色检测海马神经元凋亡情况。结果显示，与Control组相比，Model组海马神经元凋亡率明显增加(P<0.01)。与Model组相比，SI-M、SI-H组海马神经元凋亡率明显降低(P<0.05或P<0.01)(Fig 4)。进一步Western blot检测海马神经元凋亡相关蛋白表达，结果显示，与Control组相比，Model组cleaved-caspase-3蛋白表达明显升高，Bcl-2蛋白表达明显降低(P<0.01)。与Model组相比，SI-L、SI-M、SI-H组cleaved-caspase-3蛋白表达降低，Bcl-2蛋白表达升高(P<0.05或P<0.01)(Fig 5)。

Fig 4 Comparison of apoptotic rate of hippocampal neurons

Fig 5 The expression levels of cleaved-caspase-3 and Bcl-2 in hippocampal neurons n=3)

2.5 SI对海马神经元NF-κB p65信号通路相关蛋白表达影响Western blot检测海马神经元NF-κB p65信号通路相关蛋白表达。结果显示，与Control组相比，Model组p-IκBα、p-NF-κB p65蛋白表达均明显升高(P<0.01)。与Model组相比，SI-L、SI-M、SI-H组p-IκBα、p-NF-κB p65蛋白表达均明显降低(P<0.05或P<0.01)(Fig 6)。

Fig 6 The expression of NF-κB p65 signaling pathway proteins in hippocampal neurons

3 讨论

AD是老年人常见的神经退行性疾病，临床主要表现记忆力损害。AD发病机制复杂，主要包括Aβ神经病毒学说、胆碱能神经功能抑制、Tau蛋白学说以及神经炎症机制等[11]。其中Aβ神经病毒学说在AD的发生、发展中被广泛研究，研究学者认为淀粉前体样蛋白酶切代谢产物Aβ是AD发病早期发挥主要诱因[12]。研究发现，Aβ能够诱导海马神经元炎症和凋亡，导致神经元细胞丢失[13]。神经元细胞大量丢失是AD典型病理特征之一，海马神经元凋亡则是神经元丢失的表现形式。因此，以Aβ诱导海马神经元凋亡为基础，探究AD发生、发展中的分子调节机制尤为重要。既往研究证实，NF-κB/p65信号传导在神经元炎症反应和凋亡中发挥重要作用[5]。NF-κB共有5种蛋白组成，静息状态下在细胞质内NF-κB与IκBα结合形成复合物。当IκBα被激活形成p-IκBα后，IκBα会发生泛素化并降解，从而释放结合NF-κB p65。而释放的NF-κB p65会被进一步磷酸化形成p-NF-κB p65，增强其和定位信号，进入细胞核促进下游基因表达[14]。研究显示Aβ25-35能够通过激活IκBα/NF-κB通路，诱导海马神经炎症，增加神经元凋亡，进而导致海马神经元存活率降低[15]。另外，抑制NF-κB活化能够明显降低Aβ诱导的海马神经炎症和神经元凋亡，改善神经元细胞丢失[16]。因此，抑制NF-κB p65信号激活已逐渐成为阻止Aβ诱导海马神经炎症和神经元凋亡的目标。SI是一类与神经系统疾病密切相关的异黄酮类化合物总称。研究发现SI能够增加去卵巢大鼠海马突触密度，改善海马功能[17]。另外，研究也证实SI能够通过调控AD大鼠海马组织caspase-3活性，改善AD大鼠学习记忆能力[18]。在脑缺血/再灌注损伤大鼠模型，SI能够通过抑制NF-κB活化降低海马神经炎症反应，减少海马神经元凋亡[10]。基于以上研究，我们推测SI可能通过调控NF-κB p65信号通路影响AD海马神经炎症和神经元凋亡。为此，本实验通过体外培养原代海马神经元，观察SI对Aβ诱导海马神经炎症和神经元凋亡的影响。

本实验首先通过体外原代海马神经元分离培养与鉴定，结果显示10 d可见海马神经元之间的突起形成网状，胞体呈锥体状和纺锤状，伴有长轴突和树突形成。荧光显微镜下观察神经元NF200染色呈红色，细胞核染色呈蓝色，表明原代海马神经元培养与鉴定成功。Aβ1-42是常用于AD体外细胞模型研究。众多研究已证实Aβ1-42能够明显促进海马神经元凋亡。为此，本研究以海马神经元终浓度30 μmol·L-1的Aβ1-42处理48 h构建体外细胞模型。结果显示，与Control组相比，Model组海马神经元存活率明显减低，凋亡率明显升高，表明Aβ1-42诱导海马神经元凋亡模型构建成功。为明确SI对Aβ1-42诱导海马神经炎症和神经元凋亡的影响及作用机制。本实验通过设置SI-L、SI-M和SI-H浓度，观察海马神经元存活率、炎症、凋亡率以及NF-κB信号活化情况。MTT和TUNEL染色检测显示，与Model相比，SI-L、SI-M和SI-H组海马神经元存活率明显升高，凋亡率降低。Western blot检查显示，与Control组相比，Model组海马神经元COX-2、TNF-ɑ、p-IκBα、p-NF-κB p65、cleaved-caspase-3蛋白表达均明显升高，Bcl-2蛋白表达明显降低，表明Aβ1-42能够通过活化NF-κB p65，诱导海马神经炎症和神经元凋亡。与Model组相比，SI处理后能够明显抑制NF-κB p65信号活化，降低COX-2、TNF-ɑ、cleaved-caspase-3表达，促进Bcl-2蛋白表达。以往研究显示COX-2启动子含有NF-κB结合位点。在炎症激活状态下，p-NF-κB与COX-2生成呈正相关[15]。TNF-α是NF-κB强烈的激活剂，而NF-κB的激活能够诱导细胞释放TNF-α，从而形成一个正反馈NF-κB活化途径[10]。

综上所述，SI能够抑制Aβ1-42诱导的海马神经炎症和神经元凋亡，其机制与调控NF-κB p65信号通路相关。本实验初次在细胞层面上证实了SI在海马神经炎症和神经元凋亡中的保护作用，后续将在体内动物实验中进一步探究SI在AD大鼠海马神经炎症和神经元凋亡中的保护作用以及NF-κB p65信号的上游调控机制，以期为AD的SI防治提供更多参考依据。

(致谢：感谢安徽医科大学科研中心的老师给予的帮助！)