多功能皮特不动杆菌3K32菌株的发酵优化

王鹏，车永梅，李雅华，赵方贵，王耀斌，姚甲淋，刘月田，刘新

(1. 山东青岛烟草有限公司，山东青岛 266109；2. 青岛农业大学生命科学学院/山东省高校植物生物技术重点实验室，山东青岛 266109；3. 施可丰化工股份有限公司，山东临沂 276023)

氮、磷和钾是植物必需的大量元素，氮和磷是核酸、核蛋白和磷脂等重要生命物质的组成成分，钾参与调节气孔运动、多种酶活性及细胞渗透势等，在植物生长发育过程中发挥重要作用。植物对氮、磷和钾的需求量大，土壤中可溶性氮、磷和钾往往不能满足作物的需求。长期以来，农业生产中主要通过使用化学肥料补充植物需要的氮、磷和钾等元素。化学肥料的大量使用引发一系列生态问题，如，土壤肥力下降，土壤微生态环境恶化及大气和水体污染等[1]。如何降低化学肥料用量是目前农业生产中亟需解决的问题。

土壤中90%～98%的钾以矿质形式存在[2-3]，大部分磷以难溶性化合物形式存在，仅有0.1%的磷能被植物直接吸收利用。生产中使用的磷肥中75%～90%的磷会很快与Ca2+、Fe3+、Fe2+和Al3+等结合形成难溶性磷。土壤微生物在土壤元素转化过程中发挥重要作用，如，固氮菌可以将大气中游离态氮转化成植物可以直接吸收利用的氮，解磷菌和解钾菌分别能将土壤中不溶性磷和钾转变为植物可以直接吸收利用的可溶性磷和钾[2,4]。利用土壤有益微生物提高土壤有效氮、磷和钾含量是减少化学肥料用量及提高肥料利用效率的理想措施[5]。人们对固氮菌研究较早，对其固氮作用和机理研究较深入。近年来解磷菌和解钾菌受到广泛关注，目前已有多种解磷和解钾微生物被分离鉴定。不同解磷菌和解钾菌的解磷和解钾能力、生物学特性及对环境的适应性等存在差异。从杭州西湖和武汉巢湖等地分离到的解磷菌分别具有分解有机磷和无机磷的作用[6-7]；从香蕉根际分离到多种解磷菌具有溶解Ca3(PO4)2和大豆卵磷脂的作用[8]；从大豆根际分离的解磷菌成团泛菌(Pantoeaagglomerans)R-42具有一定分解FePO4和AlPO4的能力[9]。肠杆菌(Enterobactersp.)KM977992兼具解磷和解钾功能[10]。假单胞菌(Pseudomonassp.) S14-3分解黑云母的能力比白云母高37%[11]；从马铃薯根际分离的多种解钾菌对长石具有较强分解能力[12]；从水稻根际分离的多种解钾菌具有不同分泌生长素的能力[13]；在酸性、碱性、低温及干旱等不同环境中存在不同解钾菌[14]。陈腊等[15]从中国东北黑土区的玉米根际土壤中筛选出3株解钾菌，可耐受干旱、强碱及一定程度的酸和盐。解磷菌的促生作用在水稻、小麦、薄荷和大豆等作物上得到验证[16-18]。解钾菌可影响土壤理化性状及微生物活性进而影响植物生长发育[19-20]。

目前虽然已从不同作物根际分离鉴定了多种解磷和解钾微生物，但解磷和解钾微生物资源尚不够丰富，尤其缺乏兼具多种功能且对环境适应性强的微生物。本实验室从烟草根际分离到一株皮特不动杆菌(Acinetobacterpittii)，菌株编号为3K32，该菌具有解钾、解磷和固氮等多种功能，为提高3K32菌株的增殖效率，本文拟对其培养条件进行优化，以期为其开发、利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

菌株：皮特不动杆菌3K32菌株，由本实验室自山东省高密市烟草根际土壤中分离、鉴定和保存。

培养基：LB培养基(青岛高科园海博生物技术有限公司生产)和基础培养基[蔗糖10 g·L-1、(NH4)2SO410 g·L-1、K2HPO42 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1、FeCl3·6 H2O 5 g·L-1、pH 7.2 ]。

1.2 试验方法

1.2.1 3K32菌株的活化与种子培养

将冰箱保存的菌株3K32接种在LB培养基中，置于30 ℃、120 r·min-1的摇床培养活化20 h左右。将培养好的3K32菌液按照2%的接种量接种到LB培养基中，培养20 h作为种子待用。

1.2.2 发酵培养基优化

单因素优化：将2%的解钾菌3K32种子接种到装瓶量为20%的不同发酵培养基中，30 ℃、120 r·min-1培养20 h，检测生物量OD600值。

碳源优化：采用等量的碳源(甘油、甘露醇、乳糖、葡萄糖、麦芽糖、淀粉和玉米粉)代替基础培养基中蔗糖，其他成分配比不变，培养后测定不同碳源对解钾菌3K32的生物量影响，筛选出最佳的碳源；然后对最佳碳源设置不同添加量(10、15、20和25 g·L-1)，筛选最佳浓度。

氮源优化：采用等量氮源(蛋白胨、胰蛋白胨、氯化铵、硫酸铵、硝酸钾、尿素以及豆饼粉)代替基础培养基中的硫酸铵，其他成分配比不变，测定不同氮源对菌株3K32生物量的影响，筛选出最佳氮源；然后对最佳氮源设置不同添加量(6、8、10、12、14和16 g·L-1)，筛选最佳浓度。

无机盐优化：在基础培养基成分基础上，采用不同浓度K2HPO4(0、1、2、3、4和5 g·L-1)处理，筛选最佳K2HPO4浓度；之后采用不同浓度MgSO4(0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 g·L-1)发酵处理，筛选最佳MgSO4浓度；由于FeCl3含量较少未进行优化，保存基础培养基中的含量。

正交设计优化：根据单因素试验结果，筛选对3K32菌株生物量影响显著的葡萄糖、胰蛋白胨以及硫酸镁3个因素，每个因素设计3个水平，根据L9(34)正交表进行水平设计(见表1)，以3K32菌株发酵液OD600值为生物量指标，优选3K32菌株的培养基组分。即将2%的菌株3K32种子接种到装瓶量为20%的不同发酵培养基中，30 ℃、120 r·min-1培养20 h，适当稀释，检测生物量OD600值。

表1 因素水平表

1.2.3 发酵条件优化

前期利用单因素试验研究不同温度、转速及pH等因素对3K32菌株生长的影响，表明3K32菌株的最佳发酵温度为30.12 ℃、转速为140 r·min-1、pH为8、接种量为4%、装瓶量为20%。本文在此基础上进一步利用Plackett-Burman试验和中心复合设计(CCD)试验对3K32菌株发酵条件进行优化。

1.2.3.1 Plackett-Burman试验

用Plackett-Burman试验对温度、转速、pH、接种量以及装瓶量进行检测，以发酵后的OD600值为筛选指标，以确定影响菌株生长的关键因素。采用最优培养基配方制成发酵培养基，按照表2条件进行发酵培养20 h，适当稀释，检测OD600值。试验设计见表2，试验次数为12，各因素设置高(1)、低(-1) 2个水平。

表2 Plackeet-Burman设计因素水平

1.2.3.2 中心复合设计(Central composite design，CCD)

根据Plackett-Burman试验结果，选择温度和pH作为主要因素，以发酵后的OD600值为筛选指标，依据CCD原理设计试验对2个因素进行优化。每个因素分为5个水平，因素水平设计表见表3。采用最优培养基配方制成发酵培养基，按照表3条件进行发酵培养20 h，适当稀释，检测OD600值。

表3 CCD设计因素水平

1.4 发酵优化效果检测

将3K32接种至优化培养基与基础培养基中，在最佳培养条件下培养，培养24 h时检测OD600。将3K32接种至含1%钾长石的优化培养基与基础培养基中，在最佳的培养条件下连续培养10 d后，根据李忠等[21]的方法测定培养基中可溶钾含量。

1.5 数据统计方法

文章图中数据利用SPSS(20.0版本)软件用T检验进行统计分析；表中数据利用DPS(15.10高级版)软件用Tukey法进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 3K32菌株的培养基优化

2.1.1 单因素优化

菌株3K32在8种碳源中均能生长，OD600值在1.6～2.3之间，最高为葡萄糖，并与其他碳源有显著差异，说明菌株3K32利用单糖较好，因此，最佳碳源为葡萄糖(图1A)。葡萄糖浓度试验表明，浓度为15 g·L-1的处理OD600值最高，为2.2(图1B)。

菌株3K32在7种氮源中生长有显著差异，在胰蛋白胨中生长最好，OD600值为2.4。在氯化铵和硝酸钾中生长最差，OD600仅为0.3和0.4(图1C)，说明3K32菌株能很好地利用有机氮。进一步做胰蛋白胨浓度试验，结果表明浓度为14 g·L-1的处理OD600值最高，为2.3(图1D)。

A. 碳源优化；B. 葡萄糖浓度优化；C. 氮源优化；D. 胰蛋白胨浓度优化；E. K2HPO4浓度优化；F. MgSO4浓度优化。

无机盐优化结果表明，菌株3K32的生长对MgSO4以及K2HPO4均有需求，MgSO4、K2HPO4的最佳浓度分别为2 g·L-1和0.4 g·L-1。

2.1.2 培养基正交优化

根据单因素试验结果，葡萄糖、胰蛋白胨和硫酸镁等3个因素对发酵结果有较大影响，因此设计3因素3水平正交试验，进一步优化培养基组合成分，结果见表4。

表4 正交试验结果及极差分析

续表4 正交试验结果及极差分析

正交试验结果表明，A、B、C因素的极差值分别为0.339、0.409、0.277，根据极差R大小可知影响3K32菌株生长的各因素主次顺序为：B>A>C，即胰蛋白胨>葡萄糖>硫酸镁， A因素各水平的平均值不同，说明A因素水平的变化影响生物量，其中A2的值最高，因此A2为最佳水平，同理，B2和C2为B因素和C因素的最佳水平，因此，最佳组合为A2B2C2，即葡萄糖浓度为15 g·L-1，胰蛋白胨浓度为14 g·L-1，硫酸镁浓度为0.4 g·L-1。

根据以上结果，3K32菌株最佳培养基配方为葡萄糖15 g·L-1，胰蛋白胨浓度为14 g·L-1，K2HPO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.4 g·L-1，FeCl3·6 H2O 5 mg·L-1。

2.2 菌株3K32的发酵条件优化

2.2.1 Plackett-Burman设计确定关键因素

利用Design-Expert 8.0.6设计的方案进行Plackett-Burman试验，检测温度、转速、pH、接种量以及装瓶量等因素对3K32菌株生物量的影响，以确定对3K32菌株影响最显著的因素，试验结果见表5。运用Minitab 15软件对结果进行回归分析和显著性检验，结果见表6和表7。表7表明，模型的F检验结果为0.005，模型极显著(P<0.01)。从表6可以看出温度、转速及pH对3K32菌株生长具有正效应，接种量及装瓶量对3K32菌株的生长表现负效应。对3K32生物量影响最大的为pH，影响贡献率为56.34%，其次为温度，贡献率为12.75%。因此选取这2个因素进行响应面优化试验。

表5 Plackett-Burman试验设计结果

表6 各因素对3K32菌株生物量的影响

表7 Plackett-Burman 试验结果方差分析

2.2.2 响应面优化试验

根据Plackett-Burman试验结果，利用中心复合设计(CCD)原理，选取温度和pH为自变量，以3K32菌株生长量为响应值进行响应面优化。每个自变量取5个水平，中心复合设计和响应面结果见表8。

表8 CCD试验结果

用Minitab 15对试验数据处理，得到3K32菌株的生物量OD600的二次回归方程:

OD600=1.577+0.156 5A+0.177 4B+0.003 8AB-0.362 9A2-0.337 4B2

响应值的方差分析见表9，二次回归方程模型的P<0.01，说明回归模型具有极显著意义。失拟项P=0.005<0.05，表明方程模型存在一定的误差。根据试验结果的方差分析(表9)和两因素之间交互作用的等高线图(图2A)和响应面图(图2B)可知，温度与pH的交互作用对3K32菌株生长的影响差异不显著，因此，最佳发酵温度为30.21 ℃，pH值为8.05。通过以上结果分析，优化后3K32菌株的最佳发酵条件为：初始pH 8.05、培养温度30.21 ℃、接种量4%、转速120 r·min-1、装瓶量20%。

表9 CCD试验结果方差分析

图2 温度和pH交互作用对3K32菌株生物量的等高线图(A)和响应面(B)

2.3 3K32菌株发酵优化效果

利用优化后的培养基与基础培养基在最佳的培养条件下培养3K32菌株，检测其菌落数，结果表明(图3)：优化后的培养基中3K32菌株的生物量为2.7×109CFU·mL-1，为优化前的2.278倍。经过优化后的培养基与基础培养基(含1%钾长石)同时接种3K32菌株，连续培养10 d后，优化后的培养基可溶钾含量为58.35 μg·mL-1，较基础培养基中的可溶钾含量提高了5.3倍。

图3 优化培养基对3K32菌株生物量(A)和溶钾性能(B)的影响

3 讨论与结论

土壤中微生物在土壤营养元素转化过程中发挥重要作用，利用土壤中的微生物将植物难以利用的氮、磷和钾转化为植物可以直接吸收利用的氮、磷和钾，提高土壤有效氮、磷和钾含量，是提高作物产量、维护土壤健康、维持农业绿色可持续发展的理想措施[22-23]。本实验室前期自烟草根际土壤筛选出一株皮特不动杆菌(Acinetobacterpittii)菌株3K32，该菌同时具有解钾、解有机磷和无机磷及固氮作用，为一株具有较高开发利用价值的多功能菌。

不同功能微生物的发酵培养条件不同。从小麦根际分离的解磷假单胞菌(Pseudomonassp.)MS16最适温度和pH分别为22.5 ℃和7，葡萄糖能提高其解磷能力[16]。大豆根际的解磷泡盛曲霉(Aspergillusawamori)S29最适碳源为麦芽糖，最适氮源为硫酸铵[24]；李新新等[25]从梨园土中分离的假单胞杆菌属(Paenibacillussp.)解钾菌最适碳源和氮源分别为麦芽糖和蛋白胨；吴红艳等[26]从番茄根际分离的解钾胶质类芽孢杆菌(Paenibacillusmucilaginosus)最适碳源和氮源分别为可溶性淀粉和酵母膏。3K32菌株的最适氮源和碳源分别为葡萄糖和胰蛋白胨(图1)。培养基各成分的比例、浓度及培养基的pH和装瓶量等因素均影响微生物的生长和生物学功能[27]，本文利用正交试验和响应面设计等研究手段对3K32菌株的培养基和培养条件进行了优化，3K32菌株最佳培养基组分为葡萄糖15 g·L-1、胰蛋白胨14 g·L-1、硫酸镁0.4 g·L-1、磷酸氢二钾2 g·L-1；最适发酵条件为温度30.21 ℃、pH 8.05、转速140 r·min-1、接种量4%、装瓶量20%；在优化的培养基和培养条件下其生物量达到2.7×109CFU·mL-1。