适用于食用菌担子结构观察的冷冻切片技术*

余秋雨，严 冬，刘 宇，王守现，高 琪

（1.北京市农林科学院植物保护研究所，北京 100097；2.东华大学化学化工与生物工程学院，上海 201620）

食用菌子实体的形成和发育机制是近年来食用菌领域的研究重点。从细胞生物学层面对子实体结构进行观察是研究子实体形成、发育最为有效和直观的方法[1]。杂交育种是目前食用菌新品种选育的主要方法，明确担孢子的核相和有性生活史是担子菌开展杂交育种的基础[2-3]。孢子内的细胞核数直接影响担子菌的有性生殖模式[4]，解析担子中细胞核的行为从而明确担孢子中的核数，不仅是研究担子类食用菌有性生活史的基础，而且对开展食用菌新品种的育种工作来说也极有必要。

便捷的连续切片及亚细胞结构定位技术，有助于通过细胞显微结构观察食用菌担子结构及其细胞核变化规律。常用的切片方法有徒手切片法、石蜡切片法和冷冻切片法等。徒手切片法是进行动、植物组织显微观察时最实用的方法之一，其不需要专门的仪器设备和特殊化学试剂（脱水剂、包埋剂等）处理。但观察效果与样品处理后的软硬程度和切片的形态密切相关，且在制片过程中样品的组织结构易被破坏，难以得到薄而完整的切片[2]。例如常用的刀片压切法，将样品组织夹在两块刀片间压切，得到的切片往往破损较多，有些含海绵组织较多的样品，在海绵组织受压复原时会因吸入空气而使显微视野下出现气泡，严重影响观察结果[5]。由此可见，该方法对操作者的技术要求较高。石蜡切片法已广泛应用于动、植物组织的显微观察中，在大型真菌如双孢蘑菇（Agaricus bisporus）、黑木耳（Auricularia auricula）和橘黄裸伞（Gymnopilus spectabilis）等子实体的研究中也有应用[6-8]。但石蜡切片法的步骤多、耗时长，所使用的试剂如二甲苯毒性较大，会对操作者的身体健康造成一定影响[9]。另外，在石蜡切片染色过程中食用菌材料不易着色[10]，高温融蜡这一操作极易导致样品组织结构和染色体的损伤，并且石蜡自发荧光的干扰会使其不适于荧光染色以进行一些其他的免疫荧光染色观察[11]。

冷冻切片法，是将样品组织置于低温条件下，待其硬度达到一定要求时进行切片。与常规的石蜡切片法相比，冷冻切片的制作过程无需脱水、透明和浸蜡等操作，不会因高温融蜡而造成样品组织的损伤，可保持样品原有的形态，常用于原位杂交、组织化学和免疫定位等研究[12-13]。李建霞等[12]以毛白杨的子房组织为例，优化了直接包埋冷冻切片技术的冷箱温度、冷台温度和冷冻时间，获得了较好的切片，并在其他植物组织上验证了该方法的普适性。张力平[14]根据工作经验和试验，改良固定液成分，探索出一套适用于植物病原真菌的冷冻切片技术。姚娟妮等[15]将冷冻切片技术用于植物病原菌侵染的预检。由于不同种类的样品组织具有不同的性质和特点，相应的冷冻切片制备方法也存在一定差异。食用菌的子实体和菌丝体较软，尤其是子实体的菌褶部分较小、易碎且含水量高，常规切片耗时长、操作复杂，不能满足食用菌显微结构观察的试验需求。鉴于冷冻切片具有操作便捷、用时短、组织完整性好等优点，对冷冻切片技术进行优化，建立高效且适用于食用菌组织的冷冻切片技术，以期为食用菌的分类鉴定、有性生活史研究和新品种的选育提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

丝球小奥德蘑（Oudemansiella apalosarca）菌株JZB-2115055、香菇（Lentinula edodes）菌株JZB-2102217和平菇（Pleurotus ostreatus）菌株 JZB-2101390，由北京市农林科学院植物保护研究所食用菌研究室提供。

1.1.1 栽培料配方

丝球小奥德蘑栽培料：棉籽壳50%、木屑30%、麸皮18%、石灰2%，含水量60%～65%；香菇栽培料：木屑78%、麸皮20%、石膏1%、葡萄糖1%，含水量50%～55%；平菇栽培料：棉籽壳39%、玉米芯39%、麸皮20%、石灰2%，含水量60%～65%。

1.1.2 主要试剂与仪器

海藻糖、甘油、蔗糖、0.1 mol·L-1KH2PO4、0.1 mol·L-1Na2HPO4·12H2O、 0.001 9 mol·L-1NaH2PO4·2H2O、0.008 1 mol·L-1Na2HPO4·12H2O，购自国药集团化学试剂有限公司；冷冻切片组织包埋剂，购自Leica公司；4，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI），购自Sigma公司；戊二醛固定液（2.5%戊二醛），多聚甲醛固定液（4%多聚甲醛），购自Solarbio公司。

CM1950冷冻切片机，Leica公司；IX71荧光倒置显微镜，Olympus公司。

1.2 试验步骤

1.2.1 固定

用镊子选取丝球小奥德蘑的菌褶组织，用0.1 mol·L-1磷酸缓冲盐溶液（PBS）清洗2次，加入含有不同成分的固定液，于4℃下固定，弃液体，得到固定好的样品。对照组不加固定液。不同固定方式及分组见表1。

表1 丝球小奥德磨的菌褶组织的不同固定方式Tab.1 The different fixation method for Oudemansiella apalosarca gill

1.2.2 预处理

将固定好的样品用PBS清洗2次～3次后，设置5个分组（P1～P5）进行预处理。P1：海藻糖5%、甘油10%，室温孵育1 h；P2：海藻糖10%、甘油5%，室温孵育1 h；P3：蔗糖20%和甘油10%，室温孵育1 h；P4：分别按照30%、40%、50%、60%、70%的乙醇梯度水溶液顺序进行处理，各梯度均处理10 min；P5（CK）：对照，不进行预处理。P1～P4进行预处理后弃去液体，得到预处理的样品。

1.2.3 包埋

将样品托放至样品准备台，-10℃预冷5 min，预冷后利用冷冻切片包埋剂进行逐层包埋，直至样品全部被包埋，在样品台上继续冷冻直至包埋剂凝固。

1.2.4 切片

用冷冻切片机进行切片。箱体和冷刀温度设定为-20℃，将包埋好的样品固定在样品台上，将样品表面修饰平整后，设置6个分组（T1～T6）进行切片。T1：切片厚度为4 μm；T2：切片厚度为6 μm；T3：切片厚度为8 μm；T4：切片厚度为 10 μm；T5：切片厚度为12 μm；T6：切片厚度为20 μm。

1.2.5 制作显微玻片

切片完成后，用毛笔挑取切下来的材料放置于载玻片上，用ddH2O清洗2次，去除残留的包埋剂，晾干得到干净的载玻片。

1.2.6 品红染色试验

向洁净的载玻片上滴加品红染液，将盖玻片盖于染色区域，在盖玻片四周涂抹指甲油封片，将载玻片置于显微镜下进行观察。

1.2.7 荧光染色试验

使用干净的载玻片，在需染色区域滴加30 μL DAPI染色液，将盖玻片盖于染色区域，四周涂抹指甲油封片，冰盒内静置1 h。将载玻片置于荧光显微镜下，在激发波长405nm、发射波长488nm下进行观察。

1.2.8 技术适配性验证

采用改良后的冷冻切片技术分别对平菇子实体、香菇子实体和香菇菌丝体等材料进行切片。在显微镜下观察切片效果，验证该技术在食用菌领域的适配性，并优化不同食用菌组织材料的最适切片厚度。

2 结果与分析

2.1 固定条件优化结果

各组样品使用不同固定方法进行固定，之后均添加海藻糖5%、甘油10%作为冷冻保护剂进行相同预处理，统一设置切片厚度为12 μm。不同固定方式对切片的影响见图1。

图1 不同固定方法下丝球小奥德蘑的冷冻切片Fig.1 Freezing microtome section of Oudemansiella apalosarca under different fixation methods

如图1所示，与固定后的样品相比，对照组F5（CK）组织细胞破损严重，且担子细胞轮廓不清晰，无法观察到完整的细胞形态。经过固定的样品（F1～F4），细胞结构相对完整、清晰。与F1（戊二醛固定液固定）的样品相比，F2（多聚甲醛固定液固定）的样品有少部分组织仍易出现破损情况。F1固定20 min后，样品的担子细胞轮廓清晰且结构完整，可满足大部分光学染色和荧光染色需要。F3和F4切片结果显示，菌褶组织固定时间超过1 440 min时，组织可完全浸入固定液中，但都会对细胞组织造成严重破坏，影响组织的完整性。

2.2 预处理条件优化

不同预处理条件对切片的影响见图2。

如图2所示，P5（CK）未经预处理的组织细胞破碎，损伤严重。P4（酒精梯度脱水）的样品，细胞内失水严重，造成孢子大面积皱缩损伤。P3（蔗糖20%、甘油10%预处理）的样品，其组织在一定程度上保持了完整性，但担子细胞失水皱缩严重，细胞界限不清晰。P2（海藻糖10%、甘油5%预处理）的样品，其担子细胞界限清晰明显，但海藻糖浓度过高仍会导致担子细胞失水皱缩。P1（海藻糖5%、甘油10%预处理）的样品，其担子细胞界限明显清晰，无失水皱缩现象，便于显微结构观察。

图2 不同预处理条件下丝球小奥德蘑的冷冻切片Fig.2 Freezing microtome section of Oudemansiella apalosarca under different pretreatment methods

2.3 丝球小奥德蘑担子观察的最适切片厚度

按照设定的不同切片厚度（T1～T6）进行切片后，发现T1（切片厚度4 μm）和T2（切片厚度6 μm）的切片中部破损严重，有较大空隙，因此后续只对T3～T6的切片进行品红染色观察，结果见图3。

图3 不同厚度的丝球小奥德蘑冷冻切片Fig.3 Freezing microtome section of Oudemansiella apalosarca with different thicknesses

如图3所示，品红染色后丝球小奥德蘑的担子及菌丝轮廓更加清晰，便于观察。对比观察结果发现，T3～T5（切片厚度为 8 μm～12 μm）处理下观察结果最为理想；切片厚度越薄，菌褶中心部菌丝组织越容易破碎；T6（切片厚度为20 μm）易出现多层担子细胞现象。因此，观察丝球小奥德蘑单个担子细胞内情况时，最适切片厚度为8 μm；观察整体菌褶组织情况时，最适切片厚度为12 μm。

2.4 荧光染色效果

对丝球小奥德蘑冷冻切片进行荧光染色，观察结果见图4。

图4 丝球小奥德蘑冷冻切片荧光染色Fig.4 Fluorescent staining of freezing microtome section of Oudemansiella apalosarca.

如图4所示，通过使用DAPI染色液进行荧光染色，可清晰观察到丝球小奥德蘑菌褶中完整的孢子、菌丝、担子细胞组织结构，以及其中的细胞核，而且信噪比较高，表明该技术可以应用于荧光染色核相分析。

2.5 改良后冷冻切片技术在食用菌中适配性

利用条件优化的冷冻切片技术，选取戊二醛为固定液，固定时间为20 min，添加海藻糖5%、甘油10%作为冷冻保护剂进行预处理，对不同的食用菌品种及部位进行切片，结果见图5。

如图5所示，改良后的冷冻切片技术适用于平菇的子实体（图5A）、香菇的子实体（图5B）及菌丝体（图5C）。由于不同种类的食用菌担子大小及菌丝直径存在差异，因此不同种类的食用菌最适切片厚度不同，其中成熟的平菇子实体菌褶中担子观察适宜切片厚度为6 μm～8 μm，可观察到菌褶中菌丝和担子完整形态结构。成熟香菇子实体及次生菌丝体观察的适宜切片厚度为4 μm～6 μm。

3 讨论与结论

组织切片是从细胞生物学层面对食用菌子实体结构进行观察研究的最为有效和直观的方法之一[1]。常用的组织切片方法有徒手切片法、石蜡切片法和冷冻切片法等，其中徒手切片法对操作者的技术要求较高；石蜡切片法步骤多、耗时长，样品组织结构易受损[9]。冷冻切片法操作较简单、耗时短，可保持样品原有的生活形态，检测结果较准确，可用于原位杂交、组织化学和免疫定位等多种研究[12]。自1891年被确定为正式的诊断方法以来，冷冻切片成为临床上帮助医生确定疾病性质的一种可靠手段，在疾病诊断中广泛应用[15]。近年来，冷冻切片技术被逐步应用到植物研究中，多用于观察植物器官结构，如高度木质化材料、植物花器官、植物微管骨架以及植物组织化学方面[15]。谢佩松等[16]利用冰冻切片技术，对草本植物水稻和麦冬的根、茎、叶进行了冰冻切片，观察其显微结构和木质素的显微化学定位，获得了高质量的图片。朱登峰等[17]研究发现，快速冷冻切片法处理的植物细胞结构保存较好，木质素染色清晰，且操作方法简便、快速、有效。宁代锋等[18]建立了一种直接包埋冷冻和适当回温相结合的方法，不仅可以制作出植物细胞基本结构保存完整的组织切片，而且避免了使用冰冻保护剂的弊端。

目前对食用菌的切片观察大多使用其他的切片法。万佳宁等[11]运用包埋切片法制备了草菇（Volvariella volvacea）子实体不同发育时期的菌褶切片，并运用荧光显微镜和激光共聚焦显微镜清晰观察到草菇担子细胞中的核相以及在减数分裂中的变化等。王瑞娟等[9]运用改良石蜡切片法制备了金针菇（Flammulina velutiper）子实体不同发育时期的切片，观察其菌褶和菌柄的细胞结构，发现以柠檬烯为透明剂时金针菇子实体组织结构清晰、完整、无皱缩。万佳宁等[19]通过优化石蜡切片方法对香菇子实体发育初期组织结构进行观察，结果表明Van-Clear为最适透明剂，以其制备的石蜡切片中香菇子实体各部分组织结构清晰、完整、无皱缩变形。张鹏[8]通过石蜡制片法制片观察木耳（Auricularia auricula）内部结构。酒连娣[20]运用石蜡切片和徒手切片相结合的方法，对亚侧耳（Panellus serotius）原基到成熟子实体各阶段的材料进行解剖研究。而使用冷冻切片技术对食用菌显微结构进行观察的报道较少，分析其主要原因可能是食用菌组织，尤其是菌褶部分易碎且含水量高，常规的冷冻切片方法并不适用于食用菌组织切片。

因此，此次针对食用菌的材料特点建立一种适用于食用菌担子结构观察的冷冻切片技术，经验证可成功应用于丝球小奥德蘑、平菇和香菇子实体。该冷冻切片技术条件为：选取戊二醛为固定液，固定20 min，添加海藻糖5%、甘油10%作为冷冻保护剂进行预处理。切片厚度应根据不同的食用菌品种稍加调整，丝球小奥德蘑子实体切片厚度的选择范围为8 μm～12 μm，平菇子实体切片厚度的选择范围为6 μm～8 μm，香菇子实体及菌丝体切片厚度的选择范围为4 μm～6 μm，此时有助于获得质量较高的组织切片。该技术具有无毒、快速、操作简便、切片厚度薄、可用于免疫研究等优点，可显著提高食用菌组织切片的质量，为食用菌的细胞结构观察提供有力支持，为食用菌育种研究提供有效的方法保障。